Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов arvicola теrrеsтris для репродукции поксвирусов

 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований вирусов. Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток водяной полевки, свободного от контаминантов, культивируемого на доступных питательных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих водяные полевки. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСХИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИХ (19) 11111 (51)5 C 12 И 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П.1НТ СССР (21) 4635366/30-13 (22) 10.01.89 (46) 07.12.90. Бюл. М 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной био-. логии (72) А.А.Царева, А.А.Исаенко и !О.В.Немцов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Жданов В.М., Гайдамович С.Я.

Общая и частная вирусология. N.

1982, т.1, с.468-471.

Сюрин В.Н., Белоусова P.Â., Фомина Н ° В. Ветеринарная вирусология.

M.: Колос, 1984, 372 с.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований вирусов.

Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток водяной полевки, свободного от контаминантов, культивируемого на доступных питательных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих водяные полевки.

Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов водяной полевки (МЭВП) получаЮт трипсинизацией мозга пяти эмбрионов от одной самки водяной полевки (Arvicola terresrris). Эмбрионы извлекают с соблюдением правил асептической работы и помещают в стерильную чашку Петри с раствором Эрла, содержащ м пенициллин и

2 (54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК МОЗГА

ЭМБРИОНОВ ARVICOLA TFRRFSTRIS ДЛЯ

РЕПРОДУКЦИИ ПОКСВПРУСОВ (57) Изобретение относится к экспериментальной биологии и может быть использовано для генетических исследований вирусов. Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток водяной полевки, свободного от контаминантов, культивируемого на доступных питательных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих водяные полевки. 1 табл. стрептомицин в десятикратной концентрации. Промывают трехкратной сменой того же раствора, переносят эмбрионы по одному в сухую стерильную чашку

Петри. Извлекают головной мозг и переносят его в новую чашку Петри, промывают раствором Эрла, содержащим 200 мкл/мл пенициллина и

200 мкл/мл стрептомицина . Мозговую ткань пяти эмбрионов измельчают, промывают тем же раствором Эрла, перея1сят в колбу для трипсинизации, заливают 0,25Х-ным раствором трипсина, о подогретым до 37 С и оставляют на

5-10 мин при комнатной температуре, Затем трипсин нейтрализуют небольшим количеством сыворотки, клетки осторожно дважды отмывают средой "Игла

МЕМ", заливают новую порцию среды

"Игла МЕМ", содержащей 100 мкг/мл канамицина и энергично пипетпруют.

1611928

Подсчитывают количество жизнеспособ; ных клеток, доводят их концентрацию до (2-2,5).10 кл/мл средой "Игла

I, NEN", содержащей 10Х эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, (0,6 г/л глютамина, 100 ед/мл канамицина.. Разливают суспензию клеток в сосуды для культивировании. Ионослой образуется через 48 ч. Через 10

72 ч клетки пассируют 1:3. Последую-! щие пересевы осуществляют через 34 сут, Клетки снимают смесью 0,02Х— ного версена (2/3-4/5) и 0,25Х-ного трипсина (1/3-1/5), без центрифуги- 15 рования, дважды обмыв монослой прогретой до 36,5ОС смесью и проинкубировав в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем -клетки ресуспендируют в свежей среде "Игла 11KN", 20 содержащей 10Х эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 0,6 г/л глютамина и один из антибиотиков, обладающих антимикоплазменным действием в профилактической дозе. 25

Штамм перевиваемых клеток МЭВП депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промыс- ( ловых животных Всесоюзного НИИ экспе- 30 риментальной ветеринарии ВАСХНИЛ ВСКК (CXR) под номером 21.

Штамм перевиваемых клеток МЭВП имеет следующие морфологические и кариологические характеристики.

Клетки линии МЭВП имеют морфологию глиальных клеток с многочисленными отростками. Иногда встречаются нейроноподобные клетки. Ядра округлой и овальной форм. Ядрышки различной величины и формы от двух до семи в ядре. Морфология клеток культуры на разных уровнях пассажей сохраняется, Кариотипический анализ. Распределейие числа хромосом определяют подсчетом хромосом в 100 метафаэных. пластинках. На каждом исследованном пассаже анализируют не менее 20 метафазных пластинок, окрашенных Сметодом дифференциального окрашивания хромосом.

Кариологический анализ показывает, что клетки штамма МЭВП сохраняют хро(5 мосомы, характерные для нормальнсго кариотипа до 40 пассажа. Однако уже на 10 пассаже появляются полиплоидные клетки (14Х), на 20 пассаже число их уменьшается до 4Х и возрастает до 35Х к Зо пассажу. На 40 пассаже популяция на 65Х состоит из полиплоидных клеток, тлеющих 70 хромосом. Хромосомные перестройки не обнаружены.

На 50-м пассаже доля полиплоидных клеток составляет 27Х, клетки с

36 хромосомами выделяются в модальный класс.

На 56-м пассаже полиплоидные клетки составляют 14Х, Модальный класс представлен клетками с числом хромосом 36(36Х) и 37(31Х).

Гетерогенность обусловливается вариацией в числе гомологов по отдельным парам хромосом . Так, часть клеток популяции содержит в первой паре два неперестроенных гомолога; второй тип клеток — один неперестроенный гомолог, второй — с делецией короткого плеча; третий тип клеток содержит три гомолога: два неперестроенных, короткое плечо третьего гомолога делецировано. Почти во всех клетках вторая пара представлена тремя гомологами; наблюдаются потери самых меюпсих хромосом набора в 15

17-й парах

С 72 пассажа начинается стабилизация хромосомного набора культуры.

Процент нолиплоидных клеток понижается до 27Х, клетки с 36 хромосомами становятся преобладающим классом и составляют 55Х от всей популяции клеток.

На 90-м пассаже модельный класс составляют клетки с 36 хромосомами (55Х), доля полиплоидных клеток (6872 хромосомы) равной 11Х.

Таким образом, кариотип клеток линии 11ЭВП псевдодиплоидный, т ° е. сохраняет нормальное диплоидное число (2п = 36), но структура кариотипа этих клеток отличается от нормы.

Культуральные признаки, Среда цля культивирования — среда "Игла

МЕ1", содержащая 10Х эмбриональной сыворотки крупного рогатогс скота, 0,6 г/л глютамина и 100 ед/мл канамицина. Культивирование проводят при

37 С. Посевная доза 1 10 кл/мл. Частота пассирования 3-4 сут. Кратность рассева 1:3 — 1:6.

Иэоферментная характеристика. Сопоставление электрофоретической подвижности глюкоэо-6-фосфатдегидрогена1611928

30

5 зы и лактатдегидрогеназы клеток штамма МЭВП на уровнях 20, 35 пассажей с харатеристикой ферментов в стандартных образцах обнаруживает наличие изоферментов с идентичной электрофоретической подвижностью, Эти данные подтверждают видовую принадлежность клеток.

Контаминация. При электронно-микроскопическом анализе штамма МЭВП на уровне 10, 70 пассажей посторонних агентов не обнаружено. При изучении в люминесцентном микроскопе препаратов, окрашенных ДНК-флюорохромами контаминанты, не выявлены.

При выделении на селективных средах клетки штамма МЭВП свободны от вирусной, микоплазменной, гибковой и бактериальной контаминации, на уровнях 10, 65, 90 пассажей.

Хранение клеток штамма МЭВП. Клетки штамма МЭВП хранят в замороженном состоянии в жидком азоте при -196 С, Режим замораживания: снятые со стекла смесью версена, и трипсина и ресуспендированные в свежей среде клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 107 эмбириональной сыворотки КРС до концентрации (5-10) х х 10 кл/мл. Затем медленно при посб тоянном перемешивании добавляют равный объем свежей ростовой среды, содержащей 10K эмбриональной сыворотки

KPC и 20Х глицерина. Суспензию разливают по ампулам и замораживают в смеси спирта и.жидкого азота при понио и жении температуры на 1 С/мин до -40"С с последующим погружением в хранилище биопродуктов. Режим восстановления. Ампулы с клетками после извлечения из жидкого азота помещают в водяную баню с температурой 38 С, постоянно меняя положение ампулы. Суспензию размороже>гных клеток переносят в колбу с соблюдением правил асептики. Порциями, постоянно перемешивая с интервалом в 1-2 мин, добавляют ростовую среду в количестве, составляющем 0,5; 0,5;

1; 2; 3 части на объем содержимого ампулы. Затем суспензию центрифугируют, осадок ресуспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток, долю жизнеспособных и разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток

1 ° 105кл/мл.

Пример 1. Способ культивирования вируса оспы крыс.

Из культурального сосуда с клетками штамма МЭВП на уровне 90-ro пассажа удаляют среду культивирования. Монослой клеток два>гпы ополаскивают подогретой до 36,5 >С смесью 0,25Х-ного раствора трипсина (1/3-1/5) иь0,027-, ного раствора версена (2/3-4/5). Сосуд с клетками помещают в термастат при 36,5 С на 3-5 мин (до начала отслаивания клеток). Оставшиеся клетки ресуспендируют в среде роста "Игла МЕМ" с 10Х эмбриональной сыворотки

КРС и разливают на пять культуральных сосудов. Культуру 91-го пассажа инкубируют при 37 С в течение 2 сут о до момента Ф >рмирования сплошного слоя, Перед заражением среду из культуральных сосудов сливают, клетки дважды отмывают раствором Эрла и вводят

1 мл среды, содержащей 3.10 ООЕ вируса. Контакт осуществляют при

37 С в течение 1 ч. Затем монослой трижды отмывают раствором Эрла для удаления неадсорбировавшегося вируса, заливают средой "Игла МЕГ1". с 2;>;-ной эмбриональной сыворотки КРС и инкубируют при 37 С. Сбор вируса произвоо дят через 72 ч после заражения. Клеточную культуру дважды замораживают и оттаивают для освобождения внутриклеточного вируса в поддерживающую среду и определяют титр впруса по образованию бляшек в культуре клеток

CER. Титр равен 6,2+Г),5 lg БОЕ/мл.

При культивировании вируса в клетках

40 линий ВНК-21 (с13) и Vera его титр равен 5,2+0,5 lg БOE/мл и 5,9+0,5 1g

БОЕ/мл соответственно.

Пример 2. Способ культивирования поксвируса водяной полевки.

Монослой клеток МЭВП на уровне 95 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, иш1>пцируют поксвирусом водяной полевки в дозе 3 х х 10 ООЕ, титр вируса при культинит

50 ровании составляет 5,9+0,5 1В БОЕ/мл., При культивировании вируса на клетках линий ВНК-21 (с13).и Vего титр равен 4,8 0,5 lg БОЕ/мл и 5, 4+ M,5 1g БОЕ/мл соотвественно.

Результаты репродукции вирусов оспы крыс и водяных полевок штамм

135 в различных культурах клеток представлены в таблице.

1611928

Формула из обретения

Штамм перевиваемых клеток мозга эмбрионов Arvieolа сerгescгis ВСКК (CXE) Р 21, для репродукции поксвирусов.

Таким образам, штамм может быть использован для реиродукции и изучения вирусов, поражающих водяных полевок, Титры вируса в 1g БОЕ/мл

Культура клеток

Оспа крыс Вирус водяных полевок штамм 135

Составитель .И. Тареева

РеДактоР Н. Бобкова ТехРеД М.Коданич с

Корректор Т. Колб

Заказ 3812 Тираж 485 Подписное

ЭЙИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )K-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

ВНК-21 (с13)

Чего МЗВП

5„2+0,5

5,9+0;5

6 2+0 5

4,8+0,5

5,4+0,5

5 9+0 5