Способ получения целлюлазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам непрерывного культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов. С целью повышения выхода целевого продукта и увеличения продуктивности процесса непрерывное культивирование продуцентов TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM BKMF-367, T.VIRIDE BKMF-374, T.OUREOVIRIDE BKMF-2807 на I стадии накопления биомассы ведут на питательной среде, содержащей, мас.%: пшеничные отруби 0,3-0,4

хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4

биомассу гибберсиба 0,45-0,5

однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,25-0,30

сульфат калия 0,20-0,22

сульфат магния 0,025-0,030

воду водопроводную - остальное. На II стадии получения культивирование проводят на гомогенизированной питательной среде, содержащей, мас.%: свекловичный жом 2,5-2,8

пшеничные отруби 0,3-0,4

хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4

нитрат натрия 0,6-0,7

сульфат калия 0,25-0,30

ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2-0,25 - остальное. В процессе непрерывного культивирования на I стадию получения биомассы PH поддерживают на уровне 4,0-4,2, а на II стадии получения целлюлазы PH 5,0-5,2. На I стадии непрерывного культивирования питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта. Способ позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования грибов рода TRICHODERMA в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

СООЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (3c9 (lf) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ИЯ3

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4468135/30-13 (22) 27. 06.88 (46) 23. 12. 90. Бюл. N 47 (71) Московский технологический институт пищевой промышл (72) В.М.Кантере, М.В.Гернет, Л.П. Замотайл ова, Т, В. Калинникова и А.П.Калинников (53) 577.15 (088.8) ! (56) Ross А., Schdgerl К. and Scheiding M. Cellulase Pruduchion by Trichuderma reesei. Fur J.Appl, Microbiol

Biutechnul. 1983, р. 29-37.

Gautam Mitra and Charles R. Qilke.

Continuons cellufase production.

Biutechnolugy and Bioengineering, 1975, 17, р. 1-13. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ (57) Изобретение относится к микробио.логической промьппленности, а именно к способам непрерывного культивирования продуцентов целлюлолитических фер" ментов. С целью повышения выхода це левого продукта и увеличения продуктивности процесса непрерывное культивирование продуцентов Trichuderma

lungibrachiatum BKMF-367, T,viride

8KMF-374, Т.uureuviride BKMF-2807

Изобретение относится к миробиологической промьпппенности, а именно к способам непрерывного культивирования продуцентов цеплюполитнческих ферментов. (51)5 С,12 N 9/42 // (С 12 И 9/42, С 12 R 1:885) 2 на I стадии накопления биомассы ведут на питательной среде, содержащей, мас, Ж: пшеничные отруби О, 3-0,4, хл опковый шрот гидролизованный 0,3-0,4, биомассу гибберсиба 0,45-0,5, однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,250,30, сульфат калия 0,20-0,22, сульфат магния 0,025-0,030, воду водопроводную — остальное, На II стадии получения культивирование проводят на гомогениэированной питательной

- среде, содержащей, мас,7: свекловичный жом 2,5-2,8 пшеничные отруби

0,3-0,4, хлопковый шрот гидролизованный 0,3-0,4; нитрат натрия 0,60,7, сульфат калия 0,25-0,30, ферментолизат каныги с содержанием редуци. рующих веществ 0,2-0,25 — остальное.

В процессе непрерывного культивирования на Е стадии получения биомассы рН поддерживают на уроне 4,0-4,2, а на II стадии получения целлюлазы рН 5,0-5,2 ° Ha I стадии непрерывного культивирования питательную среду подают в виде гомогенизата или экстракта. Способ позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования грибов рода Trichuderma в 3-5 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта целлюлаэы и увеличение продуктивности процесса, Непрерывное культивирование продуцентов целлюлаэы-грибов рода Tri1615178

chuderma ведут в две стадии, причем на I стадии накопления биомассы культивирование осуществляют на питатель— ной среде, состоящей иэ пшеничных отрубей, хлопкового гидролизованного

Шрота, биомассы гибберсиба, одноза— решенного фосфорнокислого аммония, сульфата калия и сульфата магния, а а II стадии синтез целлюлазы провоят на гомогенизированной питательой среде, состоящей из свекловично,о жома, пшеничных отрубей, хлопкового гидролизованного шрота, нитрата аммония, сульфата калия и ферментоизата каныги, при этом в процессе епрерывного культивирования на I адии получения биомассы рН поддервают на уровне 4,0-4,2, а на II адни получения целлюлаэы рН 5,0 —

2, Кроме того, на 1 стадию непре)вного культивирования питательную реду подают в виде гомогенизата или

= кстракта.

Биохимический состав исходной ка— адыги — отхода мясомолочной промышю енности, используемой в питательной реде íà II стадии культивирования,%: клетчатка 47,9-48; лигнин 30,47-31;

° ° ° елок 6,7-6,9; жир 6,44-6,8, зола ,46-8,8, Содержание аминокислот представлено в таблице .

15

25

Содержание аминокислот, г/100 r

Аминокислоты

Промытая Каныга из каныга рубца

45

i5

Аспарагин

Тр еонин

Серии

Глутамин

Пр олин

Цистин

Глицин

Алании

Валин

Метионин

Изол ейцин

Лейцин

Тироэин

Фенилаланин

Гистидин

Лизин

Аргинин

1,60

0,65

0,54

2,86

0,92

1,85

0 99

0,71

0,1

0,61

1,12

0,4

0,58

0,52

1,35

0,69

1,24

0,49

0,48

2,88

0,6

1,66

0,81

0,57

0,1

0,46

0,899

0 35

0,45

О;44

1,09

0,74

Дпя повышения питательной ценности и ее усвояемости каныгу обрабатывают ферментом целлюлаэы, Полученный ферментолиэат каныги обогащают аминокислотами, особенно стимулятора биосинтеэа целлюлазы — аспарагиновой и глутаминовой аминокислотами, содержание редуцирующих веществ достигает 0,67..

Поддержание рН íà I стадии культивирования на уровне 4,0-4,2 позволяет получить качественный посевной материал с выходом по биомассе

997 без наличия посторонней микрофлоры, обеспечивая активный синтез целлюлазы. Значение рН 5,0-5,2, которое поддерживают на II стадии культивирования, соответствует максимальному биосинтезу целлюлазы. Отклонение от предлагаемых значений рН в сторону .увеличения или уменьшения как для биомассы, так и для целлюлазы отрицательно сказывается на продуктивности непрерывного процесса на 10-11Х относительно оптимальных значений °

Изменение состава среды по представленным концентрациям, изучение запредельных значений показывает, что нарушение сбалансированной питательной среды по азоту, фосфору, углероду приводит к значительной потере продуктивности непрерывного процес- са, составляющей 27-31Х относительно оптимальных значений.

Способ непрерывного культивирования осуществляют следующим образом.

Установка для непрерывного культивирования грибов рода Trichuderma состоит иэ двух ферментеров: первого ферментера объемом л и второго ферментера объемом 10 л, при коэффициенте заполнения 0,5, Питательная среда для первого ферментера содержит, мас.Ж . пшеничные отруби 0,3-0,4, хлопковый гидролизованный шрот 0,3-.0,4, биомасса гибберсиба 0,45-0,5, однозамещенный фосфорнокислый аммоний

0,25-0,3, сульфат калия 0,2-0,22 сульфат магния 0,025-0,03, водопроводная вода остальное, для II стадии непрерывного культивирования питательная среда содержит, мас.Р свекловичный жом 2,5-2,8, пшеничные отруби

0,3-0,4, хлопковый гидролиэованный шрот 0,3-0,4, нитрат аммония 0,6

0,7; сульфат калия 0,25-0,3, ферментолизат каныги с содержанием редуциртющих еещестн 0.2-0, 2о остальное.!

6151

Культивирование начинают сначала во втором ферментере на гомогенизированной среде при 29-30 С с числом

0 оборотов мешалки 320 об/мин, аэрации, 1 объем воздуха на 1 объем среды, После 4 сут с момента начала биосинтеза целлюлазы включают первый ферментер для наработки биомассы на гомогенизированной среде или ее экстракта при 29-30 Ñ и аэрации 1 объем воздуха на 1 объем питательной среды, Через 24 ч роста гриба и максимального накопления биомассы в первом ферментере включают проток из первого ферментера во второй с одновременной подачей питательной среды в первый и второй ферментеры. При этом рН в первом ферментере поддерживают на уровне 4,0-4,2, во втором ферментере - 20

5,0-5,2 аммиачной водой.

Подпитку гомогенизированной питательной среды в обоих ферментерах осуществляют при F = 0,05 л/ч, при этом для первого ферментера D = 25

= 0,05 ч, а для второго ферментера

D = 0,02 ÷

При данном способе непрерывного процесса получения целлюлазы получают высокопродуктивный процесс, сос- 30 тавляющий 100-110 ед. л/ч.

П р и и е р 1, Непрерывное культивирование гриба Т, lungibrachiatum

BKMF-367 начинают с периодического

35 культивирования сначала во втором

О

1 ферментере при 29-40 С, аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды n =

320 об/мин с объемом питательной среды 5 л, содержащей, мас,7.: свек- . 4 ловичный жом 2,5, пшеничные отруби

0,3, хлопковый гидролизованный жом

0,3; NHS04. 0,25, ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ 0,2 остальное. 45

Ферментолизат каныги готовят следующим образом. 1 r каныги обрабатывают 1Х-ным NaOH при 1 атм, 1 ч при гидромодуле 1:20, после этого промывают водой до рН 6,0, затем доводят гидромодуль цо 1:40 цитратным буфером с рН 5 0 и добавляют препарат целлоl б брании в количестве 0,2 г, при 50 С в течение 30 ч проходит . ерментолиз, затем отделяют жидкую фракцию или фер 55 ментолиэат с содержанием редуцирующих веществ 0,6Х полученный ферментолизат каныги разбавляют водой до содержания PB = 0,2Х и готовят на ней

78 6 питательную среду для непрерывного культивирования гриба Т. lungibrachiatum, Через 4 сут, когда во втором ферментере начинается биосинтез целлюлазы, включают первый ферментер на гомогенизированной среде следующего состава, мас.7: пшеничные отруби О, I хпонковый гидрализованный шрот 0,3, биомасса гибберсиба 0,45, (МН4) НР04.

0,25; K

Гидролизат хлопкового шрота готовят следующим образом. Шрот в количестве 47 заливают водой, доводят рН раствора 1 г NaOH до 22, нагревают до 100 С и кипятят 1 ч, после о этого расчетное количество (0,37) гидролизата вводят в состав питательной среды. Биомасса гибберсиба— отход производства гибберсибалиновой кислоты — стимулятора роста клеток.

Через 24 ч культивирования в пер вом ферментере при достижении биомассы максимального значения включают проток при 0 = 0,05 ч 1 для первого — I ферментера и D = 0,02 ч для второго ферментера при одновременной подпитке гомогенизированной питательной среды в первый и второй ферментеры с расходом среды 0,05 л/ч.

В условиях непрерывного процесса и установившегося режима(который наступает через 45-50 ч от момента включения протока) для первого ферментера рН поддерживают на уровне

4,0, а для второго ферментера рН5,0 (аммиачной водой).

В условиях установившегося режима среда имеет следующий биохимический состав, мг/л: дЛя первого ферментерабелок .(по Лоури) 1,7; фосфор (общий)

4,0, азот (общий) 0,5, для второго ферментера — белок (по Лоури) 6,0, фосфор (общий) 2,1, азот (общий) 1, 1.

При этом продуктивность непрерывного процесса составляет 200 ед./ч по АФБ (активность по фильтровальной бумаге) .

Пример 2. Непрерывное культивирование. осуществляют по примеру

1, только в качестве питательной среды используют следующий состав, мас.X: для первого ферментера — пшеничные отруби 0,3, хлопковый гидролизованный шрот 0,4, биомасса гибберсиба

0,5, (NH4)g HP04 0,3; KgSOg 0,22, MgSOg ° 0,93, для второго ферментера1615178 с векловичный жом 2,8, пшеничные отруби 0,4", хлопковый гидр олизо ванный шрот 0,4, NH

В установившемся режиме в первом ферментере РН поддерживают на уровне

3,2, а Во втором ферментере — на уровне 5,2, Продуктивность непрерыв- 10 ного процесса 110 ед;л/ч.

Пример 3, Аналогично примеру

1, но на стадии получения биомассы в первом ферментере используют экстракт питательной среды, а не гомогенизат, при этом продуктивность непрерывного процесса составляет 94 ед„л/ч, П р и м .е р 4, Непрерывное куль тивирование осуществляют по примеру

l1, только в качестве питательной среды используют следующий состав, ас.Ж: для первого ферментера — пше ничные отруби. 0,35, хлопковый гидролизованный шрот 0,35, биомасса гиб берсиба 0,48; (NH4) НРО,1 0,28, К БО,1 25

:0,2 1, М8БД4. 0,28, для второго ферментера — свекловичный жом 2,65, пшеничные отруби 0,35, хлопковый гидролизованный шрот 0,35, ИН,АСМО 0,65

K ЬО,1 0,28, ферментолизат каныги с 30 содержанием редуцирующих веществ

0,22 остальное. Процуктивность непрерывного процесса составляет 100 ед. ° л/ч по АФБ.

Пример 5, Аналогично приме! У ру 1 но в качестве .продуцегта ис пользуют штамм Т, ч1ride ВКМГ-374, Продуктивность непрерывного процесса по АФБ составляет 130 ед. ° л/ч.

Пример 6. Аналогично приме- 40 ру 1, но в качестве продуцента исполь зуют штамм Т. lungibrachiatum BKMF367 и Т.oureoviride BKHV-2807, Продуктивность непрерывного процесса по

АФБ составляет 104 ец. л/ч, 45

Предлагаемый способ получения целлюлазы позволяет повысить продуктивность процесса непрерывного культивирования продуцентов-грибов рода

Trichoderma в 3-5 раз по сравнению с

50 известным способом.

Формула изобретения

1. Способ получения целлюлазы, предусматривающий непрерывное двухстадийное культивирование продуцентов-грибов Trichoderma:aa питательной среде, содержащей на I стадии накопления биомассы источник углерода и воду, а на II стадии — источник целлюлазы и воду до максимального накопления ферментов, о тл и ч а ю шийся тем,-что, с целью повышения выхода целевого продукта и увеличения продуктивности процесса, непрерывное культивирование на I стадии накопления биомассы ведут на питательной среце, содержащей в качестве источника углерода пшеничные отруби и дополнительно гидролизованный хлопковый шрот, биомассу гибберсиба, однозамещенный фосфорнокислый аммоний, сульфат калия, сульфат магния при следующем соотношении компонентов, мас.7:

Пшеничные отруби 0,3-0,4

Хлопковый гидролизованный

0,3-0,4 шрот

Биомасса гибберсиба 0,45-0,50

Однозамещенный фосфорнокислый аммоний

Сульфат калия

Сульфат магния

Вода водопроводная Остальное при этом поддерживают РН на уровне

4,0 — 4,2, а на II стадии синтез целлюлазы ведут на гомогенизированной питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлазы свекловичный жом и ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ

0,20-0,25, а также .цополнительно пшеничные отруби, хлопковый гидролизованный шрот, азотнокислый аммоний при следующем соотношении компонентов, мас.X:

0,25-0,30

0 ъ 20 0 ь 22

0,025-0,030

Свекловичный жом

Пшеничные отруби

Хлопковый гидролизованный шрот

Азотнокислый аммоний

Сульфат калия

Ферментолизат каныги с содержанием редуцирующих веществ

Вода водопроводная

2,5-2,8

0,3-0,4

О, 3-0,4

0,6-0,7

0,25-0,30

О, 20-0, 25

Остальное

10 l615 l 78

Составитель В,Соина

Редактор Н,Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор М.Самборская

Заказ 3961 Тираж 481 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,301 при этом РН поддерживают на уровне

5,0-5,2.

2, Способ по п,1, о т л и ч а юшийся тем, что питательную среду подают на I стадию непрерывного культивирования в виде гомогенизата или экстра к та .