Способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в экспресс-диагностике дифтерии. Целью изобретения является упрощение способа при сохранении его чувствительности. Поставленная цель достигается за счет того, что разработана последовательность обработки анализируемых клеток либо в суспензии, либо нанесенных на нитроцеллюлозный фильтр раствором лизоцима, а затем раствором додецилсульфата натрия. Это позволяет значительно упростить способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии путем гибридизационного анализа ДНК анализируемого материала с ДНК-зондом.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ социАлистичесних

РЕСПУБЛИН (19) (ll) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4406330/30-13 (?2) 21.03.88 (46) 30.12.90. Бюп. И 48 (71) Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского (72) А.> ° Бобков, N.Р.Бобкова, N.Ì.Ãàðàåâ, С.И.Комбяровя, И.I(.Èaзурова и С.С.Маркина (53) 52.5: 575.224 2:577.2/048(088.8) (56) Infection and Immunity, 1983, 42, 48-56. (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ТОКСИГБНП11Х

КОРИНББАКТГРИЙ ДИАТГРИИ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в экИзобретение относится к медицине, и может быть использовано в экспрессдиагностике диАтерии.

Цель изобретения — упрощение способа без снижения его чувствительности.

Н данном техническом решении разработан такой способ лизиса коринебактерий диАтерии, который, с одной стороны, позволяет разрушать их клеточную стенку, а, с другой стороны, не мешает проведению гибридизационного анализа, заключающийся в том, что клетки лизируют с помощью последовательной оГряботки лизоцином и додецилсульАатом натрия (ДСН), им- . мобилизуют и денятурируют ДНК лизаты на нитроцеллюлозном Аильтре путем обработки щелочью. Затем проводят обработку Аильтра раствором, содержащим ДИК гибридной плазмиды, содержащей последовательность toxгена, после чего Аильтр подвергают (51)5 С 12 И 15/31 /./ (С 12 N 15/31, С 12 R 1:16) 2 спресс-диагностике дифтерии. Целью изобретения является упрощение способа при сохранении его чувствительности. Поставленная цель достигается за счет того, что разработана последовательность обработки анализируемых клеток либо в суспензии, либо нанесенных на нитроцеллюлозный фильтр раствором лизоцимя, я затем раствором додецилсульАатя натрия. Это позволяет значительно упростить способ индикации токсигенных коринебактерий диАтерии путем гибридизяционного анализа ДПК анализируемого материала с ДПК-зондом. радиоявтограАировянию; положительными считают пробы, дающие засветку ня радиоявтограАе. Другой вариант заключается в том,что выращивание клеток, содержащих коринебяктерии диАтерии, проводят непосредственно ня поверхности нитроцеллюлозного

Аильтря, помещенного ня новерхность питательного агяря. Лизирование клеток в этом случае проводят н следующих условиях.

Пример 1,- Клетки корцнебактерий диАтерии выращивают в 50 мл среды СД следующего состава, г/л, кязаминовые кислоты 25, дрожжевой экстракт 15, I.-триптоАян 0,2, глутаминовяя кислота 0,2, цистин 0,4, пантотенат кальция 0,01, Brain Ileart

Infusion 37, рН 7,2.

Непосредственно перед употреблением к 1 л указанной среды добавляют 2 мл среды следукщего coc1явя, г/л: Н880 225; Р-алании 1,15; ни161l 6991

30

50 котиновая кислота 1,15; биотин 0,075;

Си$0, 5Н О 0,5; Ей$0,1 7Hg0 0,8;

ИпС1 4Н О 0,3; НС1 <>и, 60 мп. Клетки вйращйвают до титра 10 кл/мл в течение 24 ч, затем осаждают центрифугированием (4000 я, 10 мин, +4 С) и ресуспендируют в 50 мл

0,01 М трис-НС1, рН 8,0. Клетки повторно осаждают и ресуспендируют в

8 мл 6yhepa, содержащего 0,5 N сахарозы, 0,01 М трис-НС1, рН 8,0. К суспензии клеток добавляют лизоцим до конечной концентрации 2 мг/мл и инкубируют в течение 2 ч при 37 С.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 8 мл буфера, содержащего 0,01 М трис- НС1, рН 8,0, 0 9 01 М 31 ТА добавляют Д(Н до 1, и

0 инкубируют ггри 65 С в течение 15 мин, 20

Для гибридизации полученные описан:— ным образом лизаты наносят по 3 мкл на нитроцеллюлозный фильтр. Денатурацию и фиксирование ДШ(на фильтре проводят, последовательно помещая его 25 на подложки из фильтровальной бума.— ги, смоченные растворами следующего состава: 1) 0,5» ЙаОН в течение

10 мин; 3) трис- НС1 . 1 N рН 7,.5 — в течение 12 мин:(повторяют дважды);

3) 0,5 М трис- ЦСТу рН 7 5 1,5 N

NaC1 — в течение 10 мин; 4) 2 х х SSC (SSC — 0,15 И 1ЯаС1, 0,015 М цитрат Na) . — в гечение 5 мин. Затем фильтр подсушивают на воздухе и псмешают в вакуумный шкаф на 2 ч при ! 80 C.

Прегибридизацию проводят в течение 4 ч при 65 С в растворе следующего состава: 5кратный раствор Ден:— хардта (раствор Денхардта, г/л: фиколл 10, поливинилпирролицон 10, бычий сывороточный альбумин 10), 5 х $$С, О,?%, ДСИ, ДНК спермы лосося 10О мкг-мл, 32> — меченую ДНК плазмиды pDT 41, используемую в ка— честве зонда, денатурируют путем кипячения в течение 5 мин с последующим охлаждением во льду. Гибридизацию проводят в течение 3 ч при

65 С, помещая фильтр лицевой стороной на поверхность гибридизационной смеси — буфера для прегибридизации с денатурированным препаратом

ДНК-зонда (0,02 мКи/мкг ДН!() — и наслаивая вазелиновое масло для герметизации. Отмывку фильтра проводят, последовательно помещая его в растворы следующего состава: 1) бу— фер для прегибридизации без добавления ДНК спермы лосося — 65 С в теФ чение 15 мин; 2) 1 х SSC — 20 С в течение 5 мин. Затем фильтр высушивают на воздухе и подвергают радиоавтографированию в течение 6 ч с применением рентгеновской пленки

PN-1 и усиливающего экрана ЭУИ-1.

Анализ 99 штаммов коринебактерий дифтерии, выделенных от больных и носителей (a качестве положительных контрольных проб использованы контрольный токсигенный штамм С.diphtherial и штамм Г.Coli, содержащий гибридную плазмиду pDT- 41, в качестве отрицательных контролей использованы нетоксигенные штамм С.diphthsrciae < 1030 и штамм Е.Coli, не содержащий плазмид) выявляет наличие коринебактерий дифтерии в 98 случаев.

П р и м е p ?. Колонии клеток коринебактерий дифтерии выращивают при 37 С в течение ?4 ч на поверхности нитроцеллюлозного фильтра, помещенного на поверхности агара 1,5

СД с добавлением 0,2 Tween 20. Лизис клеток проводят, помещая фильтр на подложку из фильтровальной бумаги такимобразом, чтобы последняя постоянно смачивалась соответствующим раствором. Обработка фильтра включает следукщие этапы: 1) 0,01 М трис- НС1, рН 8,0, 0,5 М сахароза — 20 С в течение 20 мин; 2) 0,01 М трис-НС1, рН 8,0, лизоцим 20 мг/мл — 37 С в течение 10 мин; 4) 1", ДСН, 0,01 трисПС1, рН Я,О. — в течение 15 мин над водяной баней 100 С на расстоянии

15 см, Затем фильтр подсушивают на воздухе. Денатурацию и фиксирование

ДНК на фильтре проводят так же, как описано в примере .1. Результаты анализа контрольных токсигенных штаммов и нетоксигенных штаммов показывают ту же чувствительность, что и в примере 1.

Таким образом, разработанный способ позволяет упростить проведение определения токсигенных коринебактерий дифтерии без снижения его чувствительности. формула и з о б р е т е н и я

Способ индикации токсигенных коринебактерий дифтерии, предусматривающий разрушение.клеток лизоцимом и детергентом, нанесение образца

Составитель Т. Забойкина

TexPед g.0лийнык Корректор Н. Ревская

Редактор М.Недолуженко

Заказ 4097 Тираж 495 Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,(01

S 161699 на фильтр и гибридизацию его с ДНКзондом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа при сохранении точности, в качестве детергента используют додецилсульфат

1 б натрия, а на фильтр наносят клеточный лизат, при этом клетки разрушают при температуре 65 С до или при температуре 100 С после нанесения на фильтр.