Способ получения днк-полимеразы 1 еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к способам получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, а именно к способам получения ДНК-полимераэы I I .scheri- chia coli, инфицированной лизогенным фагом X. , которая находит применение в генноинженернмх эксперимента;;. Уелъ изобретения - повышение выхода и удельной активности фермента. Изобретение заключается в том, что после разрушения клеток, осаждения фермента из клеточного экстракта полимином II, фракционирования сульфатом аммония и обессолнвания осуществляют хроматографнческую очистку в три стадии: на солозе КГ 0/24, с элюцией в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 1,0 М в буферном растворе, на CL сефарозе 6В, связанной с лнгандом-краснтелем красно-коричневым 2К при соотношении 1,2-2,4 мкМ красителя на 1 мл сефарозы, при элюцин в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 0,8 М в буферном растворе, и на солоэе АГ при элюцни фермента в аналогичных условиях. При этом на ПСРХ стадиях очистки в качестве исходного используют 0,005-0,05N калннфосфатный буфер, содержащий О,0005-0,005М /5-меркаптоэтанола и 0,05-0,5 мМ ЭДГА, рН 7,0-8,0. Изобретение позволяет получить г.ыход ДНК- полимеразы 1 45Я с удельной активностью 16000 гд./мг белка. 1 табл. с Ј V С а N: СС сс

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ разом.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

AO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ ССО» (21) 4424563/13 (22) 12,05.88 (46) 23.01.91. Бвл. 1 3 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" и Всесоюзный научноисследовательский институт особо чистых биопрепаратов (72) P.Ñ.Âaéòêÿâè÷åíe, P.Ï.Ìàðöèøàускас, 3.А.Баронайте, О.Ф.Суджювене, И.-Г.И.Песлякас, О.Л.Громова и Л.П.Гаврюченкова (53) 577.15(088.8) (56) Lipdell Т.D. et al Bioch Biophys. Acta, 1979, v.562, р. 231.

Kelly W.S., Stump К.Н. J. Biol, СЬеш. 1979, v. 254, р.3206-3210. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛНК-ПОЛИМЕРЛ3H I ESCHERICHIA (;01 7 (57) Изобретение относится к способам получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, л именно к способам получения ЛНК-полимераэы T. 1;scherichia coli, инфицированной лиэогенным фагом А., которая находит применсние в генноинженерних эксперимента;;.

11елЬ изобретения — повышение выхода

Изобретение относится к способам получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, а именно к способам получения JlHK-полимераэы I. Е.coli, которая находит применение в генноинженерных экспериментах.

1lель изобретения - повышение выхода и удельной активности фермента.

Способ осуществляют следующим об.

„„SU„„1622393 А 1 (51)5 С 12 ! 9/14//(С 12 N 9/14, С 12 R 1:19) 2 и удельной активности фермента. Изобретение элключлется в том, что после разрушения клеток, осаждения фермента иэ клеточного экстракта полимином II, фракционировлния сульфатом аммония и обегсолнвлния осуществляют хроматографическую очистку в три стадии: на солозе КГ О/24, с элвцией в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 1,0 М в буферном растворе, На CI, СЕфароЭЕ 6В, CIIËÇaÍÍOé С rrVr;»Iдом-крлсителем красно-коричневым 2К при соотношении 1,2-?,4 мкМ крлгителя нл 1 мл гефароэы, при элюцин в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 0,8 М в буферном растворе, а и на голоэе АГ при элюции фермента в лналогичных условиях. При этом на Bc ex стадиях очистки в клчестве исходного используют 0,005 вЂ,05М C калийфосфатнь|й буфер, содержащий

0,0005-0,005М /Ъ-мерклптоэтанолл и

0,05-0,5 мМ Э)!ГЛ, рН 7,0-8,0. Изобретение позволяет получить гыход )1НКполимерлзы 7 457, с удельной активностью 16000 ед./мг белка. 1 тлбл.

В ка естве продуцентл "НК-полимераsbl I используют лиэогенный штамм

Escherichia en!i 1(71 964 (ВКПМ P-2!99), инфицированный TepMoHIIfIóöèðóåìbIè 2 лиэогенным флгом 11, имеющим ген ро1 Л.

Клетки Fscherichia coli Я1 964 разрушают в 0,01 М калийфосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,001 М f -меркаптоэтанола, 0,0001 М ЭЛТЛ и 65 мг/л лиэоцима, обломки клеток осаждают

Приготовление дисперсной фазы. В отдельной емкости проводят при перемешивании растворение. в смеси 30 мас.ч. диметилформамида и 42 мас.ч. воды следующих компонентов, мас.ч.: метакриловая кислота 4,1, метиленбисакриламид 2,7, персульджт аммония

1,03, при комнатной температуре. Полученный раствор представляет собой дисперсную фазу.

Формирование эмульсии н полимериэация. В дисперсионную среду прн перемешивании и барбатахе аргоном вводят дисперсную фазу. Включают обогрев реактора и проводят полимеризацию при 70 С в течение 5 ч. Палее гранулы сорбента отделяют от реактора фильтрованием, отмывают водой и детергентом и зятем дистиллированной водой. Фракционируют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракцию 80120 мкм.

Получение аффинного сорбента - СЬ сефарозы 6 — красно-коричневый 2К.

К 180 мг СЬ сефароэы 6В прибав" о ляют 40 мл воды, нагревают до 60 С и при перемешиванин механической мевалкой прибавляют небольшими порци" ями 478 мг красно-коричневого 2К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г WaC1 и перемешивают при 60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до

80 С, прибавляют 2,1 r На СОэ, перемешивают 2 ч, фильтруют и отмывают о холодной и горячей (80 С) водой до попучения бесцветного фильтратя. Получается сорбент, содержащий 1,4 мкИ красителя красно-коричневого 2К ня мл СЬ сефарозы 6В. Приготовленный сорбент CI. сефароза 6 — кпасно-коричневый 2К имеет формулу

С00Н

ОН =ц /

Nao s / NH !NH

$ор.

О-се(рарога CL-6B

162239 центрифугированием при 10000 8 в те-чение 1 ч. Осадок отбрасываюг, а щентрифугат используют для выделения фермента. Фермент и нуклеиновые кислоты осалдают иэ экстракта 0,6Х-ным раствором полимина 1Т с экстракцией изосадка ДНК-полимераэы 1 0,5 И раствором калия хлористого, фракцнонируют сульфатом аммония, обессоливают и хро-10 матографируют на колонке с еолоэой

КГ О/24 в линейном градиенте КС1 от

«О до 1,0 М в 0,005-0,05 И калийфосфатном буфере с рН 7,0-8,0,содержащей

0,0005-0,005 И р-меркаптоэтанола и 15

0,05-0,5 мИ ЭДТА.В дальнейшем фермент обессоливают диализом и проводят хромотографию на колонке с СЬ сефарозой

6В, свя"àííîé с лигандом-красителем красно-коричневым 2К, при соотношении 1,2-2,4 мкИ красителя на мл сефароэы, в линейном градиенте КС1 от .

О до 0,8 И в аналогичном буфере, как и на солоэе КГ О/24. Фермент обессоливают диализом и проводят хромато- 25 графию на колонке с солозой АГ в линейном градиенте КС1 от О до 0,8 И в аналогичном буфере, как и на солоэе

КГ О/24. Хроматографическая стадия на солоэе КГ О/24 улучшает очистку ДНКполимеразы I от большей части балластных белков: очистка достигает

96 раэ, выход 65-70_#_ (в известном способе соответственно в 2,5 раза и 39K).

Хроматография íà Cl, сефарозе 6В— красно-коричневый 2К приводит к значительной очистке препарата ДНК-полимеразы I от-дезоксирибоэндонуклеазных примесей. Вйход фермента на этой стадии 49-50Х, очистка — 62,7 раз (в иэ- 40 вестном способе соответственно 467, и

50 раэ) ° При хроматографии на солоэе

АГ выход фермента составляет 40-45Х, очистка 880 раэ (по известному способу соответственно ЗОХ и 76 раэ). По 45 данным электрофореза на ПААГ в присутствии DS-NA чистота ДНК-полимеразы I составляет 83,27,. Препарат прак тически своборен от деэоксирибоэндонуклеазных примесей. 50

Пример 1. Получение сорбента — солозы КГ О/24.

Приготовление дисперсной среды реактор, снабженный мешалкой, обратным холодильником и термометром, вводят 325 мп тридекана н стабилизаторы суспензии (9 мл) Span-85 и (0,7 мл)

Tween-85, перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона.!

62

Для определения концентрацию красно-коричневого 2К на сефлрозе и элк- . енте измеряют оптическую плотность при 525 нм и согласно молярному коэффициенту экстинкцни красителя (13500 м л см ) находят количество непрореагировавшего красно-коричневого ?К. Из разницы между взятым количеством красно-коричневого 2К и найденным в элюенте находят количество лигандл в мкмолях нл мл сефароэы

Получение сорбента — солозы Af .

Приготовление дисперсной среры.

В термостативный реактор емкостью

1,5 л, снанбженный механической мешалкой с регулируемым числом оборотов, холодильником и трубкой для барбатирования аргона, помещают трирекан (600 ч), сорержащнй Ярап-85, проводят барбатаж лргоном в течение 0,5 ч.

Приготовление дисперсной фазы. В отдельной емкости на 0,5 л приготавливают раствор диэтиламиноэтилметакриламида (26 ч .) в 1,7 М растворе нот рия хлористогo (360 w,) и титруют до рН 7,6 соляной кислотой. В раствор вводят метиленбисакриллмид (!4 ч.) и инициатор - персульфлт аммония (0,8 ч.), которые растворяют при нагревании в течение 2 мин.

Полимеризация. В рисперсую среду при перемешивлнии ЗОО об./мин в течение 15 мин при комнатной температуре вводят дисперсную фазу. Включают обогрев реактора при 70 С. Лроо цесс полимериэации проводят в течение 3 ч. Иешалку выключают, гранулы сорбента отделяют от реактора фильтрованием, отмывают от тридеклна водой с детергентом и многократно водой.

Фракционируют мокрым рассеяом нл ситах, выделяя фракции 50-.100 мкм и

100-200 мкм.

Вьделение и очистка ДНК=полимераэы I. а) Для получения ферментного экстракта 250 г клеток F..Coli КИ 964 с успендируют в 1400 мл 0,01 М калий фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,001 М Р-меркаптоэтанола, 0,0001

И ЭДТА и 65 мг/л лизоцима. Суспенэию ставят в ледяную баню и перемешивают стеклянной палочкой до получения гомогенной суспенэии. Суспенэии кле" ток обрабатывают экструзиоиньи деэинтегратором. Обломки клеток осаждают центрифугированием при 10000 р

2393 6 в течение 1 ч. Выпавший осадок отбрасывают, центрифугат (1560 мл) используют для выделения фермента. б) Фрлкцноннрование ферментного экстракта полимином II и сульфатом аммония. К центрифуглту (1560 мл), полученному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивлнии в течение 30 мин добавляют 20Х-ный раствор полиминл II (48 мл) до конечной концентрации 0,67,, После добавления всего объема полиминл II перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт центрифугируют и течение 10 мин при

5000 g. Супернатант сливают, л полученный осадок суспендируют в 780 мл

0,01 И калийфосфатного буфера с рН 7,4 содержащего 0,001 М Р -мерклптоэтлЮ иола, 0,0001 М ЗДТА и 0,05 И KCl.

Суспензию центрифугируют в течение

10 мин при 5000 8. Супернлтант слива.вают, а ДНК-полимеразу. I экстрагируют иэ осадка 1200 мл 0,01 И калийфосфлт25 ного буфера с рН 7,4, содержащего

0,001 М Р -меркаптоэтанола, 0,1 мИ

ЗДТА и 0,5 И .КСЕ. Суспенэию центрифугируют в течение 10 мин при 5000 g.

К супернатлнту (1210 мл) добавляют

30 сухой сульфат аммония ро 70Х насыщения. Осадок собирают, растворяют в

150 мл 0,01 М калийфосфлтного буфера с рй 7,4, содержащего 0,001 М /3-меркаптоэтанола и 0,1 мМ ЭДТА, помещают

З5 в диалнэную трубку и диалиэуют в течение 18 ч против 5 л указанного буфера. Получают 180 мл диализлгл. в) Хроматография ДНК-полимеразы Е на колонке с солозой КГ О/24. Диализат

40 фермента (180 мл) подвергают хроматографии на колонке (5 25 см) с солоэой

КГ О/24, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора колонку промывают 1000 мп а5 исходного буфера. Элюирование фермен" та осуществляют линейным градиентом (3 л) KCl от 0 до 1,0 М в исходном буфере. Собирают фракции по 20 мл.

ДНК"полимераэа Е элюируется s преде5Q лах 0,75-0,30 И КС1. Активные фракции объединяют. Получают 98 мь фермент-. .ного раствора, который диллиэуют в течение 18 ч против 3 л 0,01 И калийфосфатного буфера с рН 7,4, содержа55 щего 0,001 И р-меркаптоэтанола и

О,! мИ ЭДТА. Получают 100 мл диалиэата ° г(Хроматография ДНК-полимераэы I иа колонке с CL сефарозой 6 — красно7 16?2393 коричневый 2К. Диалнзат ДНК-полимеразы Т E.coli (100 мп) подвергают хроматографии на колонке (1,5 25 см) с

СЬ сефароэой 6 — красно-коричневый 2К, содержащий 1,4 мкИ красителя

5 в 1 мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером. После нанесения Ферментного раствора, колонку промывают

100 мл исходного буфера. Элюирование 10 фермента осуществляют линейным градиентом (400 мл) KCl от 0 до 0,8 М в исходном буфере. Собирают Фракции по

8 мл. ДНК-полимераза элюируется в пределах 0,20-0,25 М КС1. Активные фракции объединяют и диалиэуют в течение 18 ч против 2 л 0,01 М калийфосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М Р -меркаптоэтанола и

О, 1 мИ ЭДТА, Получают 40 мл диализа-2< та. д) Хроматография ДНК-полимеразы I на колонке с солозой АГ. Диализат фермента (40 мл) подвергают хроматографии на колонке (1 10 см) с соло- 25 зой АГ, уравновешенной диализным, буфером. После нанесения Ферментного раствора колонку промывают 30 мл исходного буфера, Элюирование Фермента осуществляют линейным градиентом (100 мл) КС1 от О до 0,8 М в исходном буфере. Собирают фракции по

2,5 мл. ДНК-полимераза I элюируется в пределах 0,25-0,3 М КС1. Активные фракции объединяют и используют для концентрирования. е) Концентрирование конечного препарата. Объединенные фракции (17мл) диализуют против 1 л 0,1 М калийЬосфатного буфера рН 7,4, содержаще- 40 го 0,001 И дитиотрейтола и 507, глицерина (по об*ему). Диалиэ продолжают в течение 16 ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранят при -20 С. Выход ДНК-поли- 45 о меразы I составлят 457 с удельной активностью 16000 ед/мг белка.

Активность ДНК-полимеразы Т определяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панкре50 атической дезоксирибонуклеазой) . 3a единицу активности принимают то количество ДНК-полимеразы I, которое при 37 С за 30 мин включает 10 наномолей дезоксирибонуклеозидфосфатов в

ДНК-матрипу.

Основным показателем качества ДНКполимеразы I является отсутствие дезоксиэндонуклеазных примесей.

Пример 2. Способ получения

ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хромато-графии на колонках с солозой КГ О/24

СЬ сефарозой 6В - красно-коричневый

2К, содержащей 1,2 мкИ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,005 М калийфосфат с рН 7,0, 0,0005 М (5-меркаптоэтанола и 0-,05 мм ЭДТА. Выход фермента составляет 44Х с удельной активностью 15500 ед/мг белка.

Пример 3. Способ получения

ДНК-полимeрaэы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солоэой КГ О/24, CL сефарозой 6В - красно-коричневый

2К, содержащей 2,4 мкМ красителя/мл сефароэы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,05 И калийфосфат с рН 8,0, 0,005 M Р-меркаптоэтаноля и 0,5 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 427 с удельной активностью 15000 ед/мг белка °

Пример 4. Способ получения

ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ

О/24, СЬ сефарозой 6 — красно-коричневый 2К, содержащей 3 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий

0,1 М калийфосфат с рН 8,5, 0,01 М

Р -меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 35Х с удельной активностью 10000 ед/мг белка.

Пример 5. Способ получения

ДНК-полимеразы I осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ О/24, CL сефарозой 6 — красно-коричневый

2К, содержащей 1 мкИ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,001 М калийфосфат с рН бу5 ° Оу0001 М Р-мер» каптоэтанола и 0,01 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 257 с удельной активностью 8000 ед./мг белка.

Результаты представлены в таблице.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа .заключается в том, что получают высокоочищенный препарат с выходом 45Х (по известному способу 301), удельной активностью

16000 ед./мг белка (по известному способу 8394 ед./мг) и концентрацией фермента 31,8 ед./мкл (по известному способу 10 ед./мкл). По сравне1622393 нию с известным способом выход увеличивается в 1,5 разя, удельная активность почти в 2 раза, а концентрация активности более, чем в три разя.

Хроматогряфическую очистку проводят на отечественных сорбентях.

Ф о р и у л а и з о б р е т е н и я

Выход и якти меразы I

Выход фермента, Х

Пример

Удельная активность, ед/мг белка

Концентрация фермента, ед/мкл

Известный

2

4

30 8394

45 16000

44 15500

43 15360

35 10000

25 8000

31,8

31

31

Составитель F.. Воробьева

Техред П.Олийнык Корректор И.Демчик

Редактор Н.Яцола

Заказ 88 Тирах Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по иэоор ниии и открытиям пр тиям п и ГКНТ СССР !

13035, Иосква, %-35, Раувская наб., д. 4/5

П оизводственно-издательский комбинат Патент, г.увгор д, у . р

° 1

У о л. Гага ина 101

Способ получения ЛНК-полимерязы I

Escherichia coli, предусмятривяющий использование продуцентя, инифицированного термоиндуцируемым лизогенным фагом ф, раэрущение клеток, центрифугнрование, осаядение фермента и нуклеиновых кислот из экстракта полимином 11, фракционирование сульфатом аммония и обессоливание с последующей очисткой хроматографией с концентрированием конечного продукта,о т л ич а ю шийся теи,что,с целью повы, щения выхода и удельной активности, фермента, очистку хроматографией осуществляют ня колонке с солозой

КГ О/24 с использованием исходного

0,005-0,05 И калийфосфатнпго буфера, содержащего 0,0005-0,005 И,ф-меркаптоэтанола и 0,05-0,5 иМ-ои ЭДТА рН 7,0-8,0 к элюции в линейном градиенте хлористого калия от 0 до

1,0 М в буферном растворе, зятем проводят хроматографию на колонке с

CL сефароэой 6В, связанной с лигандом-красителем красно-коричиевъв 2К при соотновении 1,2-2,4 мк1Я красителя на 1 ил сефярозы, с использованием того ае исходного буфера и элюции в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 0,8 M в буферном растворе, и

20 хроматографию ия колонке с солоэой

АГ с тем ме исходным буфером и s аналогичных условиях злюции. ! вность РНК-поли