Способ определения активности каталазы в плазме крови

 

Изобретение относится к биохимии и медицине и позволяет определять активность каталазы плазмы крови в норме и при гипербилнрубинемин. Цель изобретения - сокращение времени определения при одновременном создании возможности определения активности каталаэы в плазме при гнпербнлирубинемии. Готовят стандартную и исследуемую пробы. В стандартную пробу к плазме крови добавляют в конечной концентрации 0,009-0,09%-ный растпор азида натрия и перекись водорода, а з исследуемую пробу - перекись водорода. После инкубации в течение 55-60 с в исследуемую пробу плазмы крови вносят азид натрия, а затем в обе пробы - молибдат аммония. Спектрофотометрически определяют разность экстинкций и рассчитывают активность каталаэы плазмы крови. КЛ

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„, 1622821 (SI) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4436831/14 (22) 06. 06 ° SS (46) 23.01,91. Нюн. М 3 (71) Институт биохимии АН ЬССР и

Гродненский государственный медицинский институт (72) В.С, Васильев, Г,К. Новицкий, И.И. Черннкевич, Ф,С. Ларин и В.M. Цыркунов (53) 11абораторное дело, 1988, М 1, с. 16-19. (54) СНОСОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

КАТАЛАЗЫ В Ш1АЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к биохимии и медицине и позволяет определять активность каталазы плазмы крови в норИзобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения активности каталазы плазмы крови.

Цель изобретения — сокращение времени и создание возможности определения активности каталазы в плазме при гипербилирубинемии.

Способ осуществляется следующим образом.

Веноэную кровь (3 мл) центрифугируют

1О мин прн 3000 об/мин, при этом в качестве антикоагулянта используют гепарин иэ расчета 50 ЕД/мл крови, Для приготовления стандартного образца к О, 1 мл плазмы крови добавляют

0,1 мл раствора аэида натрия 0,2-2Хной концентрации и 2 мп О,ОЗХ-ного

2 ме и при гипербилирубинемии. Цель изобретения — сокращение времени определения при одновременном создании воэможности определения активности каталазы в плазме ири гипербилирубинемин. Готовят стандартную и исследуемую пробы. В стандартную пробу к плазме крови добавляют в конечной концентрации 0,009-0,09%-ный раствор азида натрия и перекись водорода, а в исследуемую пробу — перекись водорода.

После инкубацин н течение 55-60 с в исследуемую пробу плазмы крови вносят азид натрия, а затем в обе пробы молибдат аммония. Спектрофотометрически определяют разность экстинкций и рассчитывают активность каталазы плазмы крови.

f раствора перекиси водорода (Н О ) В исследуемои пробе к О, 1 мл плазмы крови добавляют 2,0 мл 0,03%-ного раствора H>0 . Обе пробы ставят на М инкубацию при 25 С на 55-60 с, После минутного инкубнрования в исследуемую (_#_ пробу добавляют О,1 мл раствора азида Ю натрия 0,2-2%-ной концентрации с

Ф целью ингибирования реакции разложения Н<0 каталазой плазмы крови (конечная концентрация аэида 0,009-0,09%), В стандартную и исследуемую пробы с вносят 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммония, который с непрореагирой вавшеи Н О образует окрашенный комплекс. Интенсивность цветной реакции измеряют спектрофотометрически на приборе "Specol 21" (ВНР) при длине волны 410 нм. Определяют разницу экстинк1622821 ции между стандартной и опытной пробаии и производят расчет активности каталазы плазмы крови по формуле

Ьемк э где А - активность каталазы, 1 мкмоль с л Е - разность экстинкций контроль- 10 ной и опытной проб;

Ч вЂ” объем пробы, мл (3,2);

К вЂ” коэфшициент перес ета на 1 л

1азмы крови (10000);

Я вЂ” коэфРициент молярной экстинк- 15 ции перекиси водорода, икмоль (22, 2); время ннкубации проб, с (60) .

Для определения оптимальной ингибирующей концентрации азида натрия 20 (в О, 1 мл раствора) проведено исследование, результаты которого пока зывают, что 0,27-ный раствор азида натрия обладает максимальной ингибирующей способностью и превышение ука- )5 эанного верхнего предела концентрации азида натрия не приводит к большему угнетению активности ферменга, а влечет повышенный расход данного реактива, Использование концентраций азида натрия меньше 0,27. приводит к снижению ингибирования каталазы, Сл»довательно, 0,2-2_#_-ный раствор азица натрия являегся оптимальной концентра-. цией данного вещества в целях достаточного угнетения каталаэы плазмы крови (конечная концентрация азида

0,009-0,097,).

Проведенное изучение выраженности ингибирующего эффекта азида натрия показывает, что полная каталазная активность плазмы крови (без добавления азила натрия) равна 0,50 +

-I

+ 0,06 мкмоль с ° л, а остаточная (после добавления 0,2-2/-ного раствора азида натрия) О, 016 «+

«+ 0,003 мкмоль ° с л, что составляет

3,34_#_ от полной, Следовательно, выраженность ингибирующего эффекта азида

Натрия на каталазу плазмы крови достигает 96,66Х.

Для выбора оптимального времени инкубации изучена кинетика активности каталаэы. Линейная зависимость активности фермента от времени инку1 бации "охраняется в течение 55-60 с, При дальнейшем увеличении времени инкубации скорость разложения перекиси водорода каталаэой плазмы крови постепенно снижается. Сокращение времени инкубации менее 55 с ведет к уменьшению разницы экстинкций контрольной и опытной проб, а при увеличении аре.-. мени инкубации более 60 с зависимость активности каталазы от времени инкубации теряет линейный характер, Пример 1, 3 мл веноэной крови практически здорового человека (общий билирубин 14,7 мкмоль/л), взятой с использованием гепарина из расчета

50 ГД/мл, центрифугируют при

3000 об/мин в течение 10 мин, Полученную плазму крови отсасывают ы чистую пробирку, Цля приготовления стандартного образца к 0,1 мп плазмы добавляюг (),1мч О,?7.-ного раствора аэида натрия (конечкая концентрация

0,00,,) и 2 мл 0,03Х-кой перекиси водорода. В исследуемой пробы к 0,1 мл плазмы крови — 2,0 мл 0,03,-кого р; створа перекиси водорода (H О.). ()бе пробы ставят на инкубацию при 25 С ка 60 с. После ныдерживания 1 мин при этол температуре н исследуемую пробу добанляют 0,1 мл 0,2/.-ного растыора азида натрия. За.гем как н стандартную, так и исследуемую пробы вносят ко 1,i) мл 4i-ного раствора моды бддта ам окия, После 2-минутного центрифугироыания при 3000 об./мин измеряют экстиккцию станкilp Taolt u опытной проб на спектрофотометре

"Specol 21" (1НР) при длине волны

410 нм. Разница экстинкций (К) межцу контрольной и опытной пробы и в конкретном случае ранна 0,042. Используя указанную формулу, определяют активность каталазы плазмы крови:

ЬК Ч К -1

А = ††------ = 1 009 мкиозь с л .

Я 1

П р и и е р 2. Взятие крови и получение плазмы крови здорового человека проводят идентично примеру 1., Для приготовления стандартной пробы к

О, 1 мл плазмы крови добавляют О, 1 мп

17-ного раствора азида натрия (конечная концентрация 0,0ч57) и 2,0 мп

0,037-ного раствора H 0 . Исследуемую пробу готовят как в примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при

25 С на 58 с, После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 17.— ного раствора аэида натрия, Затем в стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 47-ного раствора молибдата аммония. Последующие операции прово2821

10

20 плазмы крови

55 данного фермента с применением н качестве ингибиторов азида натрия и цивнщ а калия приведены в таблице, 5 162 дят как н примере 1, Разница экстинкций между стандартнои и исследуемой пробами н данном случае 0,040. Активность ка тала эы пла змы крови Е ViK -1 -<

А = — --- — = О 994 мкмоль с л

Я, e !

Пример 3. У здорового человека проводят забор неноэной крови и выделяют плазму как в примере 1. Для приготовления стандартной пробы к

0, 1 мл плазмы крови добавляют О, 1 мл

27-ного раствора азида натрия (конечная концентрация 0,097) и 2,0 мл

О, 037.-ного раствора Н О . Исследуемую пробу готонят как в примере 1, Обе

-б пробы ставят на инкубацию при 25 С на 55 с ° !!осле инкубации и исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 2/-ного раствора азида натрия. В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл

47-ного раствора молибдата аммония.

Последующие операции проводят как в примере 1. Разница экстинкции между стандартной и исследуемой пробами н данном случае 0,038. Лктивность каталазы плазмь< крови

1 В, Ч ° К вЂ” < -1

А = ------- = D 99б мкмоль с л

< г г t

1! р и м е р 4. У больного стеднетяжелой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы крови

129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и выделение плазмы способом, описанным н примере 1. Для приготовления стандартнои пробы к 0,1 мп плазмь. крови дооанляют О, мл 0,2i-.— íîãî раствора азида натрия и,0 мл 0,037.-ного раствора Н<0<, Исследуемую пробу готовят как н примере 1, Обе пробы ставят на инкубацию при 23 С «а 60 с.

После инкубации в исследуемую пробу добавляют 0,1 мл 0,27. †но раствора азида натрия, В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мл 4/-ного раствора молибдата аммония, 11оследующие операции проводят как в примере 1.

Разница экстинкцчи между стандартной и опытнои пробами н данном случае

0,08, Активность каталазы плазмы крови

dL Ч К !

А = ------- = 1,92 мкмоль с л

E t

Пример 5. У больного среднетяжелой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы крови

129,4 мкмоль/л) проводят забор крови и вьделяют плазму как в примере 1, <1!ля приготовления стандартной пробы к О,! мл плазмы крови добавляют 0,1 мл

17.-ного раствора азида натрия и 2,0 мл

0,03/-ного раствора Н О, Исследуемую пробу готовят как в примере 1. Обе пробы ставят на инкубацию при 2S С на

58 с. После инкубации в исследуемую пробу добанляют 0,1 мл 1/-ного раствора азида натрия. В стандартную и опытную пробы вносят по 1,0 мп 47.--ного раствора молибдата аммония. Последующне операции проводят как в примере

1. Разница зкстинкций между стандартнои и опытной пробами в данном случае

0,077. Лктивность каталазы плазмы крови

ЬН вЂ” 1 -!

A; — -- — — — = 1 91 мкмоль с л т

1I р и и е р 6 ° У этог î же больного проводят взятие крови и получение плазмы крови как н примере 1, Для приготовления стандартной пробы к 0,1 мл

«лазмы крови добавляют 0,1 мп 2/-но>о раствора азида натрия и 2, С мл

0,03/-и«гo pa

А = ---- — — = I 91 мкмоль ° с л

Я

Используя известный и предлагаемый способы изучена активность каталазы крови больных вирусным гепатитом В (ВГВ) различной степени тяжести и практически здоровых доноров в сопоставлении с уровнем билирубинемии, Исследования, аналогичные предлагаемому способу, проведены с использованием и других известных ингибиторов каталаэы.

Результаты определения активности

1622821

Средняя форТяжелая форма (n = 8) Больные ВГВ легкая форма (n = 18) Контроль (n=14) Показатель ма (п.=19) Общий билирубин, м кмоль/л

Активность каталазы> мкмоль с л

Предлагаемый способ с использованием

Ф

192,4+21,7

0,03+0,004

114,6+17,3

Ф0,35 0,06

41,2+9,65 >>

Ф

О>84+0,07

16,5+3,1

О> 56+0> 06

1,91+0,13 2,42+0,18

1,01+0, 07 1,44+0,09

4 азида натрия

Предлагаемый способ с использованием

>>

2, 51+0, 20

1, 92+0, 15

1,39+0>08

О, 98+,Э, Оi цианида калия

Достоверные раз шчия показателей по отношению к контролю (р (0,05) °

Полученные данные свидетельствуют о практической идентичности активности каталазы в одинаковых группах обследованных лиц при использовании различных ингибиторов предлагаемого способа (учитывая очень высокую токсичность цианида калия, в лаборатор,нои практике следует отдать предпочтение азиду натрия), 10

Используя предлагаемый способ в плазме крови больных ВГВ средней и тяжелой формами активность каталаэы была значительно повышена, однако при известном способе такого повыше- 5 ния обнаружено не было, что указывает на неадекватность известного технического решения, Существенно, что у отдельных больных с высокой билирубинемией опреде- 20 лить активность каталазы плазмы крови известным способом оказалось невоэможным, что подтверждается следующим наблюдением, Пример 7. Больная Ч., 48 лет, 25 находилась на лечении в Гродненской областной инфекционной больнице в

1988 году. Биохимическое исследование крови показало, что уровень общего билирубина равен 260 ммоль/л ч 30 (норма — до 20,5), активность аланинамйнотрансферазы 4,5 ммоль/л ч (норма — до 0,7), обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В. Поставлен диагноз: вирусный гепатит В, тяжелая форма, При использовании известного способа определение активности каталазы провести не удалось, поскольку экстинкция (0,475) холостой пробы (с максимальной концентрациеи окрашенного10 комплекса перекиси водорода с молибдатом аммония) оказалась меньше экстинкции опытной пробы (0>684), содержащей плазму крови больной Ч.

Однако предлагаемым способом активность каталазы была успешно определена (2,16 мкмоль с, л ).

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным сокращение срока инкубации в 10 раэ, тем самым в 3 раза уменьшая длительность определения, более высокую специфичность и адекватность исследования- за счет создания воэможности определения активности каталазы в плазме крови при гипербилирубинемии, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения активности каталазы в плазме крови путем инкубации контрольной пробы, содержащей перекись водорода, и опытной пробы> содержащей плазму и перекись водорода, с последующим добавлением к обеим пробам молибдата аммония и регистрациеи оптической плотности, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью сокращения времени при одновременном создании воэможности определения при гипербилирубинемии, в контрольную и опытную пробы дополнительно вводят азид натрия в конечной концентрации

0>009-0>09%> причем в контрольную про;бу азид натрия вводят перед началом инкубации, в опытную пробу — после окончания инкубации перед введением молибдата аммония, а инкубацию проводят в течение 55-60 с.