Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается идентификации сор тов крестоцветных культур, которая необходима при селекции и семеноводстве , а также в овощеводстве. Целью изобретения является повышение достоверности и точности анализа. Способ состоит в том, что выделяют изоферменты кислой фосфатазы из образцов семян путем гомогенизации проростков в экстрагенте, содержащем аскорбинозую кислоту, цистеин-HCl, этилендиаминтетраацетат натрия, после чего проводят их электрофоретическое разд ление и по полученным спектрам изоферментов осуществляют контроль сортовой чистоты. 6 табл. I (Л с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

M А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4652329/13 (22) 16.02.89 (46) 28.02.91. Бюл. 1» 8 (71) Всесоюзиый научно-исследовательский институт селекции и семеноводства.овощных культур (72) П.Е.Кононков, Т.И.Одинцова, Л.С.Батманова и И.С.Глазкова-Степаненко (53) 631.522: 58 .083 .5(088 .8) (56) floods S. et а1. The use. of seed

and phosphotases in the determina-

tion of the puriri of F hybrid Еги.зяе1s зргощс seed. —.- Enphytica, 25, р.707-712. (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ СОРТОВОЙ ЧИСТОТЫ СЕМЯН КРЕСТОЦВЕТНЫХ КУЛЬТУР

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно в овощеводстве, селекции и семеноводстве овощных культур.

Цель изобретения — повышение до- ! стоверности и точности анализа.

Способ состоит в том, что проводят вццеление изоферментов кислой фосфатазы из образца семян путем гомогенизации проростков в экстрагенте, электрофоретическое разделение выделенных изоферментов в полиакриламидном геле и их проявление, при этом обработку осуществляют в экстрагенте, включающем аскорбиновую кислоту

0,02-0,06 М, цистеин-ЧС1 0,03

0,07 М, этиленлиаминтетраацетат натрия 0,02-0,06 М, в буфере при рН

Р1) А 01 Н 1/04 э С 01 И 33/68

2 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается идентификации сор тов крестоцветных культур, которая необходима при селекции и семеноводстве, а также в овощеводстве. Целью изобретения является повышение достоверности и точности анализа. Способ состоит в том, что выделяют изоферменты кислой фосфатазы из образцов семян путем гомогенизации проростков в экстрагенте, содержащем аскорбино" вую кислоту, цистеин-НС1, зтилендиаминтетраацетат натрия, после чего ,проводят их электрофоретическое раз-, д1вление H IIO полученным спектрам изоферментов осуществляют контроль . сортовой чистоты. 6 табл.

7,0-7,4 с последующим выдерживанием ьб: полученного гомогената при ?-6 С в 1 ф о течение 10-14 ч. 4Ф

В этом случае достигается более высокое разрешение, чем в известном способе: обнаруживается более 10 изоферментов у разных представителей семейства крестоцветных, в то время как при использовании известного спо соба -5-6.Повышение разрешающ и спо- собности позволяет с большей достоверностью анализировать сорта, различать ф ф сходные генотипы. аЪ

Пример 1. Изоферменты кислой фосфатазы, экстрагируют из 48-часовых проростков представителей крестоцветных 0,06 M трис-НС1 буфером (рН 7,2),,содержащйм 20% сахаровы, 0,04 М аскор0703

3 163 биновой кислоты, О, 05 M цистеина-НС1, 0,04 М ЭДТА-Na< (натриевая соль этилендиаминтетраацетата) и 57, Сефадекса

G-25. Экстракцию проводят в течение

12 ч при 4 0. Для электрофоретического анализа используют 15-20 мкл образца. Предварительно пробы центрифугируют при 16000 8 в течение 30 мин.

Электрофорез белков проводят в двухслойном геле: верхний (концентрирую щий) содержит 5Х акриламида, а нижний (разделяющий) — 7,57,. В концентрирующем геле весовое соотношение ак/ риламица к N,N -метиленбиакриламину составляет 20: 1, а в разделяющем—

20: 2. Дпя приготовления гелей используют следующие растворы: а) 2ОЕ-ный акриламтщ: акриламид 47,5 r; Ч,N

4 етиленбисакриламид 2, 5 г; акриламид 47,5; N,N -метиленбисакриламид

5 г; объем доводят водой до 250 мл; б) трис-ЭДТА-боратньпЪ буфер (рН 8,0}; трис-107,5 г, ЭДТА-Na< — 9 r, борная кислота — 5,5 г; объем доводят водой до 1 л. Концентрирующий гель состоит из 30 мл раствора акриламида (реагент "а"), 8 мл трис-ЭДТАборатного буфера (реагент "б"), 0,08 мп ТЕМЕДа (N,N,N -N -тетраметилендиамин), 60 мг персульфата аммо.ния и 42 мл воды. Разделяющий гель состоит из 7,5 мл раствора акриламида (реагент "а"), 3 мл трис-ЭДТАборатного буфера (реагент "б"), 0,03 мл ТЕМЕДа, 30 мг персульфата ам-, мония и 19,5 мп воды. Размеры геля составляют 170х75хЗ мм . Одновременно. анализируют 30 образцов. Перед элек- тр оф ор е з ом пр он од я т пр еэл ектр оф ор ез при градиенте потенциала 26 В/см в течение 30 мин. Р качестве электродного раствора используют трис-3РТАборатный буфер (реагент "б"), разбавленный водой в 10 раз. Электрофорез проводят в течение 2,5 ч при ь градиенте потенциала 40 В/см при 8 С.

Окранивание изоферментов кислой фос фатазы проводят прочным синим (ВК"

--соль) С Н < N О, ВГ4. Окрашивающий; раствор содержит 100 мг п(.-нафтилфос- фата (Na-соль), 1 г поливинилпирролидона К 25 (М 3400 г/моль), 200 мг прочного синего (RR-соль), 40 мл

0,25 М Na-ацетатн ого буфера (рН

5,0} и 200 мл воды. После окончания электрофореза гель промывают водой и хранят в 71-лом растворе уксусной кислоты, Остальные примеры проводят ана-логично примеру 1, используя другое количество компонентов экстрагента и на различных сортах и видах крестоцветных. Результаты представлены в табл.1-6.

В табл. 1 и 2 представлены результаты контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур, полученные согласно предлагаемому способу; в табл.3-6 — данные, полученные при различных значениях концентрации компонентов экстрагируищего буфера. Как следует из табл.) и 2, различные сорта представителей семейства крестоцветных характеризуются специфическим спектром изоферментов кислой фосфатазы, что не достигается при

20 использовании известного способа (таб.3 и 4). Предлагаемый способ позволяет обнаружить межсортовые различия (табл.1), а также гетерогенность ряда исследованных сортов

25 (табл.2) . Из табл.3-6 следует, что при выходе за пределы отмеченных значений концентраций компонентов экстрагирующего буфера и температуры эффект не достигается.

Как видно из табл.Ç,уменьшение концентрации компонентов экстрагента приводит к уменьшению числа выявляемых изоформ кислой фосфатазы, к исчезновении отдельных компонентов и появлении других, одновременно снижается стабильность получаемых результатов. Повьппение концентрации компонентов экстрагента отрицательно сказывается на качестве электрофореграмм. Оптимальные условия эксперимента достигаются при следующих концентрациях компонентов экстрагента (М): аскорбиновой кислоты — 0,02—

О, 06; цистеина-НС1 — О, 03-0, 07;

45 ЭДТА-Na — 0,02-0,06.

Как видно из табл.4, при уменьшении рН экстрагируищего буфера ниГже 7,0 не экстрагируится два наиболее подвижных компонента спектра, а при повышении ..рН выше 7,4 — три наименее подвижных компонента кислой фосфатазы.

Как видно из табл.5, при повьппении температуры экстракции за пределы на эл ектр офор ег рамме и сч езают компоненты с Rf 0,12 и 0,20. При

1 снижении температуры ниже 2 С экст-— ракт замерзает и становится непригодным для электрофоретического анализа.

Та блида

Относительна» нодвикность (Rf) в ПААГ изофермеитов кислой фосфатазы разны< сортов представителей сем. Brassickceae

1. СоРт

Компоненты, Rf

0,64 О, 74

0,12 0,20

0»2О 0,24

0,45 0,52

О 24

0,48

0,64

0,38

0,64

0»74

0,45

0,74

0,52

0,80

0,79 О 86

0,46 0,52

0,24 0,30

О, 12 0,24

0,12 0,24

0,12 0,24

0,07 0,26

0,07 0,15

0,64

0,43

0,45

0,30

0,30

0,30

0,24

0,74

0,52

0,52

0»45

0,38

0,52

0,45

0,80

0,74

0,52

0 45

0»58

0,74

0,74

0»52

0,64

0,64 0 74

0,74

0,86

0,55

0,55

0,55

0,55

0,55

0,57

0,06

0,72, 0,63

0,63

0 73

0,63

0»64

0,13

0,74

0,74

0,74

0,78

0,26

0,37 0,50 0»65 0»73 О»86

0,73 . 0,86

0,55 О 73

О» 26. 0»40 ОР 55

018026.040

0»10

0,13

Как видно из табл,6, при уменьшении времени экстракции на электрофореграмме не вкявпяются компоненты с высокой электрофоретической подвижностью (компоненты 8-10) . При увеличе5 нии времени экстракции (более 14 ч) зоны изоферментов становятся диффузными, вероятно за счет эндогенного протеолиза.

В настоящее время контроль сортовой чистоты ведется на основе анализа морфологических признаков. В СССР для определенной сортовой чистоты и видимой принадлежности семян капусты, редиса и редьки исйользуют грунтовый контроль. Однако это требует значительных затрат времени и средств, причем идентификация сортов по морфологическим признакам часто бывает 20 затруднительной. Предлагаемый способ, основанный на изучении изоферментных систем, является более точным, поскольку спектр изоферментов, в частности кислой фосфатазы, в отличие лт морфологических, является стабильКапуста брюссельская

Капуста савойская

Ликуришка

Капуста красно. качанная.

Золотой гектар, Слава

Амагер иосковская поздняя

Подарок

Капуста дикая

Капуста (разлнчнме сорта) (4)

1 .2

4

6

Редька черная Редька Грайворон: ская

Реднс . Телличний

3 6 ным призчаком и не зависит от условий выращивания. В СССР и за рубежом проверка сортовой чистоты перекрестноопыпяющнхся растений не разработана °

Формула изобретения

Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур, включающий выделение изоферментов кислой фосфатазы из образца семян путем гомоГенизации проростков в экстраген-. те, электрофоретическое разделение выделенных изоферментов в полиакриламидном геле с получением электрофоретических спектров и их последующий анализ, о т л и. ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения точности и достоверности анализа, для выделения изоферментов используют экстрагент, включающий аскорбиновую кислоту 0,02-0,06 И, цистеин-НС1 — 0,030,07 М, этилеипиаминтетраацетат натрия 0,02-0,06 М, при рН 7,0-7,4, при этом полученныи гомогенат выдерживают при 2-6 С в течение 10-14 ч. о

1630703

Таблица 2

Относительная подвижность изойерментов кислой фосфатаэы гомогенных и гетерогенных сортов сем. Brassicaceae

Компоненты, Rf

3 4 5

Сорт

7 8

1 2

1 О;Об 0,13 0,26 0,50 0,63 0,73

Редька черная гомогенный1 сорт

2 О, j3

3 О,?6

4 0,06

5 О, 13

0,37 0,50

0,42 0,50

О, 26 0,42

0,42 0 50

0,63

0,63

0,50

0,65

О, 73 0,86

0,68 0,75

0,73 0,86

0,86 1

0,26

0,40

0,13

0,26

Редька Грайворонская

0,40 0,55

0,40 0,55

0,40 0,55

0,40 0,55

0,40 0,55

0,86

0,86

0,86

0,86

0,86

0,73

0,73

0,73

0,73

0,73 гомогенный сорт

Редис Тепличный гетерогенный сорт

0,40 0,90

0,40 О, 55

0,55 0,87

О, 26 0,40

0,87

0,55

0,73

Та блица

Относительная лодвииность (Rf) в ПААГ изоферментов кислой фосфатаэы капусты брюссельской при различных концентрациях компонентов зкстрагируюцего буфера

Концентра ция аскор биновой кислоты (и) Компоненты, Rf

1. 2 3 4 5 б 7 9 10

0,52

0,45

0,45

0,45

0,45

0,20 0,24

0„12 О, 20

3, 12 0,20

9,12 0,20

0912 0,20

0,38

0,24

0,24

0,24

0,24

0,45

0,38

0,38

0,38

0,38

0,64

0,52

0,52, 0,52

О, 52

0,68

0,64

0,64

0,64

О 64

0,74

0,74 0,79 0,86

0,74 О, 79 0,86

О, 74 0,79 0,86

Диффузные эоны

Oi 50

0,38 .

0,38

0,38

О,38

6„20 Oi 38

2,12 0,20

Ф„Ф2 О, 20

6 Ф2 0,20

Ж„М2 0,20

0,64

0 45

0,45

0 45

0,45

0,74

0,52

0,52

0,52

0,52

0,45

0,24

0,24

0,24

0,24

0,64 0,74 . 0,79

0,64 0,74 0,79

0 64 0,74 0,79

Дйффуэные эоны

О 86

0 86

0,86

6>„2O О, 24 и ll2 0,20

6 „92 О, 20

el„1l2 О, 20

6 „92. 0,20

0,74

0,52

О ° 52

0,52

0152

0,45

0,24

0,24

0,24

0,24

О 50

0,3&

0,38

0t38

0,38

0,64

0,45

0 45

0,45

0,45

0,64. 0,74 0,79

0,64 0 74 0,79

0,64 .0,74 0,79

Дирфувные воны

0,86

0,86

0,86 !

0,01

0,02

0,04

0,06

0,08

Концентрацию цистеииа-йя.Р (и)

0,01

0,03

0 05

0,07

0,10

Ко нц ентр ацин

ЗДТА-Наа (Уф

0,01

0,02

0,04

0,06

0,10

1 0,10

2 О, 10

3 0, 10

4 0,10

5 0,10

1 0,13

2 . 0,13

3 0,13

4 0,26

5 0,13

0,26

0,26

0,26

0,26

0,26

0,26

0,26

0,26

0,40

0 18

1630703

Таблица 4

Относительная подвимиость (Rf) в ЛААГ изофериентов кислой фосфатазы капусты брюссельской при различных значениях рН зкстрагнрующего буфера рН зкстрагирующего буфера

Компоненты, Rf

1 3 4 5 6 10

0,45 0,52

0,45 0,52

О, 74 0,79

0,74

0,74 0>79 - 0,86

0,74 0,79 0,86

0,74 0,79 0,86

0,12

0,12

0,12

0,12

0,38

Таблица 5

Г

Отяосительная подвикность (Rf) в ПААГ иэофериентов кислой фосфатаэы капусты брюссельской при раэличной температуре экстракций

Те эх е оипоненты, Rf

Замерзание экстракта

О, !2 0,20 0,24 0,38 0,45

0,12 0,20 0,24 0,38 0,45

О,!2 0,20 0,24 0,38 0,45

О 24 О 38 О 45 О 52 0 64

0,52 0,64 0,86

Оэ 52 Оч64 0,86

О, 52 0,64 0,86

О, 74 0,79

Таблица 6

Относительная подзнкность (М) в ПААГ иэофериеитов кнслОй фосфатаэы капусты брюссельской ttptt различном времени. экстракции

> Rf

12

14

0,52 0,64

0,52, О.б4,; О;74

0,52 0,64 0,74

0,52 0,64 О, 74

Составитель В.Демкин

Редактор С.Лисина Техред М.йоргентал > Корректор Т.Палий.,Заказ 505 Тирах 377 ° Подписное

ВНИИПИ Государственного. комитета по изобретенйям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

6,7

7,0

7i2

7;4

7,6

2

6

t0,12

0,12

0,12

0,12

0,20 0,24 0,38

0,20 0,24 0,38

Оь 20 0 24 0,38

0,20 0,24 0,38

0,45 0,52 0,64

Оэ.20 Оэ 24 Оэ38

0 20 0 24 0 38

0,20 . О, 24 0,38

0,20 0,24 0 38

Диффузные эоны

0,45

0,45

0,45

0 45

0,64

0,64

0,64

0,64

0,86

0,79 0,86

О ° 79 0 86

0,79 0 86