Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью

 

Изобретение относится к биотехнологии и м.б. использовано в пищевой промышленности при производстве глюкозофруктового сиропа. Целью изобретения является повышение ферментативной активности и стабильности целевого продукта. Способ состоит в том, что проводят включение клеток Streptomyces albogrtseolis28-3 в нерастворимый носитель путем смешивания суспензии клеток в ацетате магния с водным раствором хитозана в соли кобальта с последующим осаждением водным аммиаком и отделением образовавшихся гранул биокатализатора. Изобретение позволяет увеличить активность препарата от 133 до 135,2-175 ед/г и повысить его стабильность от 42 до 46-55 дней. Кроме того, полученный препарат обладает удобной для технологического производства гранулированной формой. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)$ 12 N 11/00, 11/04

ГОСУДАРСТВЕ1+3ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4456822/13 (22) 07.07.88 (46) 15.03.91. Бюл, М 10 (71) Институт элементоорганических соединений им. А.Н,Несмеянова (72) И.А.Ямсков, С,П.Кожанова, Е.Н.Ефременко, В.А.Даванков, И.М.Грачева и М.С.Мосичев (53) 577,15(088.8) (56) Патент Франции М 2523598, кл. С 12 N 11/16, опублик, 1982.

Авторское свидетельство СССР

N. 1393847, кл. С 12 N 11/00, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к биотехнологии и м.б. использовано в пищевой промышИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, может быть использовано в пищевой промышленности при производстве глюкозофруктозного сиропа.

Цель изобретения — повышение ферментативной активности и стабильности целевого продукта.

Способ предусматривает включение клеток Streptomyces albogrlseolls 28-3 в носитель, приготовленный из хитозана и ацетата кобальта. Клетки предварительно суспендируют в растворе ацетата магния.

Суспендирование клеток позволяет получить биокатализатор с однородным распределением активности, а использование

0,1 7 ацетата магния стабилизирует целевой продукт. Суспензию клеток смешивают,, Я2, 1634715 А1 ленности при производстве глюкозофруктового сиропа. Целью изобретения является повышение ферментативной активности и стабильности целевого продукта. Способ состоит в том, что проводят включение клеток Streptomyces albogriseolis 28-3 в нерастворимый носитель путем смешивания суспензии клеток в ацетате магния с водным раствором хитозана в соли кобальта с последующим осаждением водным аммиаком и отделением образовавшихся гранул биокатализатора. Изобретение позволяет увеличить активность препарата от 133 до 135,2-175 ед/г и повысить его стабильность от 42 до 46 — 55 дней, Кроме того, полученный препарат обладает удобной для технологического производства гранулированной формой, 1 табл. с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта, а затем полученную смесь закапывают в 87ь-ный водный раствор аммиака для образования гранул целевого продукта. Гранулы отделяют и промывают водой. Конечные концентрации компонентов устанавливают следующими, мас. :

Биомасса клеток по сухой массе 3 — 10

Хитозан 1-4

Ацетат кобальта 7-15

Вода Остальное

Хитозан, являющийся гелеобраэующим полисахаридом, оказывает стабилизирующее влияние на фермент. Хитоэан растворим в кислых средах, поэтому возможно его использование в водном растворе ацетата кобальта, имеющего кислое значение рН.

1634715

55

Применение способа позволяет увеличить активность целевого продукта (от 133 до 135,2 — 175 ед./г) и его стабильность (от 42 до 46 — 55 сут).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 9 г влажных клеток (влажность 90 ) Streptomyces albogrlseolls 28-3, полученных после центрифуги рова ния культуральной жидкости и обладающих активностью 48,2 ед/г, суспендируют в

10мл 0,1%-ного раствора ацетата магния и смешивают с 20 мл раствора 1,5 мас.% хитозана в 13,5 мас.% водном ацетате кобальта (рН 4,0 — 4,5), конечные концентрации компонентов в полученном объеме смеси (30 мл) мас.%: биомасса (по сухой массе — с.м,) 3, ацетата кобальта 9, хитозана

1 (полученную смесь закапывают в 8%-ный раствор водного аммиака (рН 11,0-11,2).

Образующиеся гранулы отделяют, промывают водой и фосфатным буфером рН 7,0.

Активность влажного иммобилизованного препарата 135,2 ед./r, стабильность 46 сут.

За единицу активности глюкозоизомеразы принимают количество фермента, катализирующее изомеризацию 1 мкммоль глюкозы во фруктозу при рН 7,0 и температуре 60 С за 1 мин. В качестве субстрата используют 2М раствор глюкозы с добавлением 10 М ионов магния.

Стабильность иммобилизованного препарата определяют как время полуинактивации глюкозоизомеразы при 60 С и рН 7,0.

Глюкозоиэомеразная активность контрольного препарата, полученного по известному способу, составляет 133,7 ед./г влажного препарата и принята эа 100%, а стабильность 42 сут.

Пример 2. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 10, ацетат кобальта 8, хитоэан 2,5. Активность влажного иммобилизованного препарата 137,1 ед./г, стабильность 46 сут.

Пример 3. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокаталиэатора, мас.%; биомасса (по с.м.) 2. ацетат кобальта 10, хитозан 3,5. Активность влажного иммобилизованного препарата 81,2 ед./r, стабильность 13 сут.

Пример 4. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, %: биомасса (по с.м.) 11, ацетат кобальта

10, хитоэан 2,5%. Активность влажного иммобилизованного препарата 190,1 ед./r, стабильность 25 сут, Пример 5. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас,$: биомасса (по с.м,) 7, ацетат кобальта 15, хитозан 2. Активность влажного иммобилизованного препарата 174,9 ед./г, стабильность 55 сут.

Пример 6. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас,%; биомасса (по с.м.) 5, ацетат кобальта 7, хитоэан 1,5%. Активность влажного иммобилиэованного препарата

168,8 ед./r, стабильность 48 сут.

Пример 7. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 5, ацетат кобальта 6, хитозан 1. Активность влажного иммобилиэованного препарата 118,3 ед./г, стабильность 42 сут.

fl р и M е р 8. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м,) 7, ацетат кобальта 16, хитоэан 1%. Активность влажного иммобилизованного препарата

142,8 ед,/г, стабильность 37 сут.

Пример 9, Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокаталиэатора. мас.%: биомасса (по с,м,) 8, ацетат кобальта 10, хитозан 1,5. Активность влажного иммобилиэованного препарата 140,2 ед,/г, стабильность 47 сут.

Пример 10. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м,) 9, ацетат кобальта 7, хитозан 4. Активность влажного иммобилизованного препарата 150,2 ед./г, стабильность — 51 сут.

Пример 11. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокатализатора. мас.%: биомасса (no с.м.) 10. ацетат кобальта 8, хитозан 4,5%. Активность влажного иммобилизованного препарата

130,3 ед,/г, стабильность 40 сут, Пример 12. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%; биомасса (по с.м.) 7%, ацетат кобальта 10, хитоэан 0,5%, Активность влажного иммобилизованного препарата

188,4 ед./г, стабильность 21 сут.

Пример 13. Иммобилиэацию клеток проводят аналогично примеру 1, но вместо

1634715

0,1 -ного раствора ацетата магния используют дистиллированную воду. Конечные концентрации компонентов биокатализатора; мас.; : биомасса (по с,в.) 8, ацетат кобальта 14, хитозан 3. Активность влажного 5 иммобилизованного препарата 131,8 ед./г, стабильность 29 сут, Пример 14. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, только вместо

0,1 -ного раствора используют 0,05 -ный 10 раствор ацетата магния. Конечные концентрации компонентов биокаталиэатора, мас,; : биомассы (по с.в.) 8, ацетат кобальта

14, хитозан 3.

Активность влажного иммобилизован- 15 ного препарата 143 ед./r, стабильность 34 сут.

Пример 15, Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, но вместо 0,1 ного раствора используют 0,5 -ный 20 раствор ацетата магния. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас. : биомасса (по с.a.) 5, ацетат кобальта

14, хитозан 3. Активность влажного иммобилизованного препарата 140 ед./г, стабиль- 25 ность 32 сут.

Иэ приведенных примеров видно, что положительный эффект ацетата магния, заключается в увеличении стабильности препарата. 30

Сравнительные результаты известного и предлагаемого способов представлены в таблице.

Выбор водного раствора аммиака в качестве осадителя, а также выбор его концен- 35 трации (8 ) обусловлен тем, что именно в растворе аммиака такой концентрации происходит формование гранул с образованием гидратированной окиси кобальта необходимой механической прочности. 40

Снижение концентрации аммиака ведет к снижению механической прочности образующихся гранул и к удлинению процесса их формования.

Увеличение концентрации амиака также приводит к снижению механической прочности из-за черезмерно быстрого формирования геля.

Другие осадители (щелочи) не даю гранул необходимой прочности.

Таким образом, предлагаемый i.ëoñîá по сравнению с известным позволяет повысить активность иммобилизованного препарата на 26 — 30 (от 133 до 135,2 — 175 ед/г), стабильность на 14 — 30 (с 42 до 44 — 55 сут), а также получить целевой продукт в гранулированном виде. Предлагаемый способ прост в осуществлении, дешевый, не требует применения сложного дорогостоящего оборудования.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, заключающийся во включении клеток Streptomyces albogrlseolls 28-3 в нерастворимый носитель на основе ацетата кобальта, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности и стабильности целевого продукта, клетки предварительно суспендируют в растворе ацетата магния, затем суспенэию смешивают с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта, и проводят гранулирование геля введением полученной смеси в S -ный водный раствор аммиака, при этом конечные концентрации компонентов в препарате составляют, мас, :

Биомасса клеток по сухой массе 3 — 10

Ацетат кобальта 7 — 15

Хитоэан 1 — 4

Вода Остальное

1634715

Состав

174,9

130,8

Гранул ы

Биомасса по с.м, 5ф, ацетат кобальта 7 хитозан 1,5

126,3 с

168.8

Препарат, полученный по известному способу

133

100,0

КОНТ ОЛЬ

Порошок

Составитель В.Муронец

Редактор Т.Лазорфнко Техред М.Моргентал Корректор И.Эрдейи

Заказ 733 Тираж 367 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Конечные концентрации компонентов биокатэлизэтора по оптимальным примерам, мас.

Биомасса по с.м. 7ф ацетат кобальта 15ф, хитоаан 2 (пример 5) Активность влажного иммобилиэованного препарата, е /г

Выход активности по отношению к контролю, 7ь

Стабильность при

60 С, сут

Внешний вид иммобилизованного препарата