Способ получения препарата кислой фосфатазы из дрожжей sасснаrомuсеs cerevisiae

 

Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к способу получения ферментного препарата, содержащего кислую фосфатазу из дрожжей (КФД). Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение выхода кислой фосфатазы в расчете на количество дрожжей клеток и ускорение процесса. Способ заключается в том, что для секреции кислой фосфатазы используются иммобилизованные в 5-10%-ный криогель поливинилового спирта клети дрожжей SACCHAROMYCES CEREBISIAL, которые функционируют в среде состава, г/л: глюкоза 20

хлористый аммоний 2,0

0,2 М сукцинатный буфер с PH 5,0 до 1 л, при 28-32°С с постоянной аэрацией в реакторе проточного типа, а из получаемого на выходе из реактора раствора препарат фосфатазы выделяют осаждением холодным (от -20 до -30°С) ацетоном. Способ позволяет увеличить выход фосфатазы в 30-40 раз и ускорить процесс получения целевого продукта. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ца1 <В

А1 (5")4 С 12 N 9/16, 11/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4107962/31-13 (22) 23,06.86 (46) 07.09.89, Бюл. К 33 (71) Институт элементоорганических соединений им. A.H.Íåñìåÿíoâa и !1ГУ им. И.В.Ломоносова (72) С.В ° Рогожин, С,Н.Егоров, В.И.Лозинский, Л.В.Гавриленко, Е.С.Вайнерман и И.Н.Семенова (53) 577.15(088 .8) (56) Nildner P et а1. Purification

of protoplastsecreted acid phosphatase from bater

et Hiophys. Acta 1976, v ° 429, р.274-282.

Barboric S. et аl, Purification

and evidence for getегоgenety of

acid phosphatase from Saccharomyces cerevisiae. — Hiochem. Biophys.

Res Comm, 1980, v,95, р.404-409. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE (57) Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к способу получения ферментного препараИзобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии-, конкретно к способу получения ферментного препарата, содержащего кислую фосфатаэу, продуцентом которой являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae,è может, быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследованиях, где имеется потребность в таком ферменте как кислая фосфатаза.

2 та, содержащего кислую фосфатазу из дрожжей (КФД) . Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследованиях. Цель изобретения — повышение выхода кислой фосфатаэы в расчете на количество дрожжевых клеток и ускорение процесса, Способ заключается в том, что для секреции кислой фосфатаэы используются иммобилиэованные в 5-107-ный криогель поливинилового спирта клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые функционируют в среде состава, г/л: глюкоза 20; хлористый аммоний 2,0; 0,2 М сукцннатный буфер с. рН 5,0 до 1 л, при 28-32 С с постоянной аэрацией в реакторе проточного типа, а из получаемого на выходе из реактора раствора препарат фосфатаэы выделяют осаждением холодным (от -20 до -30 С) ацетоном.

Способ позволяет увеличить выход фосфатазы в 30-40 pas и ускорить процесс получения целевого продукта. 1 табл.

Цель изобретения — повышение выхода кислой фосфатаэы в расчете на количество дрожжевых клеток и ускорение процесса.

Способ заключается в том, что дпя секреции кислой фосфатаэы используют иммобилизованные целые клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые функционируют в среде сос— тава, г/л: глюкоза 20; хлорнстый аммоний 2,0; 0,2 И сукцинатный

72 4

40

3 15059 б)у<1)ср (pll 5,0);та 1 л, при 28-32 С с посталнной лэрлцисй в релктарс прото

tIcJiIII3t! l(1tJ1ol30t.о спирта а из получас !ÎEî !(л в((ходе из реактора растI3oj? п 1(р сплрлт 1:ислой 1)ос<1)лтлзы дрожжей D!, Ic:I»loò Ослждс(н(см холодным (20) — (-301 С л(;стоном.

IIj)It>(PItcнис ук l=,tti!èot(среды и условий функционирования иммобилизонлнн!.!х др Ржжсвых клеток позволяет

»or (?:1!3(п ь биосинтез прсимущсствен110 !io пу (1 сск1)ецпи о н((ск.(етач- 15 ((ос прос". рлнстна !(менно кислой фас1>лт:>1-«,! л использовавшие дрожжевых к.(сток 13 и)н.об:пп(зонлнном в!(де даст

130 3((>?;1;!) <>С! t> > НО;<ЦСP)t<(IB(1» КОНЦСIП рлцию фср.:(снтл E экстрлцсл:II)I)>»p i(031 20 жидкoc TIt нн)ке 1? лвиовесно!! ((ОстолнtttJn(атно;-,1! т. с.

I(t? ". IС(l > ПР ОЦ?, !; Т!1,3 ИОСТ!> CI (<1 TC> n(В от на:101:! .!1 к(.c!:Ой фосфлтлзы Jt;)

1!Он(1 .:10 !11!,!;t;1!!)!01 Р г(акл. 3(!тс:13(с((осОбC TI3, <. . г . ).:..Lo l! 13< .)>I(1еlнlю Сp <)к 013

<1)) l((E. лl!I!» 1(стс)111 13 Ц< JIОГ!.

1>< lбор !3 кс 1сстг< н<>с!(тс»3» (((! Iобlгли 3 )-!

) . :!1!I ::; с го;..,,? )жс!! крн:.. л» !(л ос 30

iloi3".. <»11.!:„ o cftlij ";t (IIU )

Об?. C J:t. 1>J (CII i L (, t!T <,;;1 Ill(i>tt".

О?(>Л,);(:;!Нт,)ЛSI)1(not(ГЕ" < "j>!Otj», silo! I

»lL та((<.трук"урай, -.. га 06<)с((с (! влет

< >3(,;1 O!!1) lt t! Т 1 (в(С ; ()13!((Jt (Л >< :>С IO

„I

33 гс >!!t! г(l клL гt>>., Об;!o t<. > : 1 .):1? !!

l!L ((< >> ) < t >It<),j)f1 < н, .И(< лл > nf (< t l

К 1, I< ТК<1. (К!IT;1 ГLJ! I>t(I>lх !3L

;<од мст >6)й(-L?t><>!.). !!10< Тli 1!Р<(; МО!) ДOC П(1 Лстсл кл . Iloijt>niыходл и !(с()ого продукт», тлi; ii yt

lIL!c 10

JIC1>0 l O <) O >1 Т < <>С 1!>1<ДЕ!И(С> t!)Э(ЛЖ! l ill!! 11(t Та:! О . 1, Il p lf t; с р 1. 50 !LI суснснзгп(1< lст>) к;l j) Ог::кс((;;t сc!1л >. 0()1> !. 3 с СL ."..> 1

s L !o, !гт ° . -. -208 <., содсржлщсll 2,-3 ° 10it)i L n.) . !л 1 I -:, смсшивлюг с 50 мл

1О> --ного во (((ого глстнорл 1!ВС да пол учсlиlл j) лl) нс."(СР )101(су сг! сиз((и Ко

TOj)?>!t PñnC0)I1COIlÈ(3ËtOT 1IOI)Llti»11!i IIO

1j)0 мк.! и за(<>эрл)ш(влют L(j)lf — 70 4 н гс ение 5 I ;lt!!. Затем переносят зяобj);1 3 it(t в xoJIogltjl bltif Ii

О т< мисра тур

24 ч (прн этом проискo,

2 И сукцинатный буфер (pH 5,0) до

1 л, 20 м(1/ч с постоянной ее аэраI!I(el, температура 30 С. Элюлт собирают в ахлаждлемый до 4 С сборник I3 течение 64 ч. Ферментный преилpllò осаждают прибавлением холодного (-20 С) ацетона при соотношении

Обьемов осадителя и элюлта 1,5:1.

Осадок отделяют центрифугированием высушивают н вакууме (0,1 мм рт.ст) нлд лктиниронлнным углем и прокаленным хлористым кальцием.

I ыход 90 мг дук i I(LI!oc TI,, 3,8 ец. лкт/10 клеток.

II р и м е р . 300 мп с спенз((и

1<лоток дрожжей S. <.01 ovl S138 шт.

38 — l I — П188, coJ1ej) ."щей 2,8 ° 109 кле— !

3ок нл I мл, сме(ш(влют с 100 мл

157.-ного рлстн )рл ПВ<; готовят ранн.)ыерн гю суспензию, которую рлсфас

1, с той разни!<Сй, что температур,< функциа (прова(и(я иммобилизовано ных клеток составляет 28 С, а тем11Lj) лтурл ацетона при осаждении белка -30 С. Получают 210 мг пре лрлтл с удельной фосфатлзнай активностью 5,2 ед/мг белка. Выход

E расчете на исх< дную биомассу

9 (продукт!(вност!.) 4,0 ед акт/10 клеток.

Пример 3. 25 мл суспензии дрожжевых к)1еток S. Cerevisiae,шт. б — 1à — ll188 содержащей 2, 1 10 клеток нл 1 мп, смешивают с 25 мл

20Х-ного раствора ПВС. Полученную равномерную суспензию расфасовывают по 50 мл ii заморлживают образцы

<) при -70 С в течение 1О мин. Далее, клк в примере 1, только температура функционирования иммобилизованных клеток 32 С, л температура ацегона при осаждс(н(и ферментного препарата -25"С. После отделения выпавшего осадка его растворяют н

10-кратном количестве дистиллирован5 15 ной воды, замораживают и высушивают лиофильно. Выход белка 45 мг. Удельная фосфатазная активность 5,2 ед/мг белка. Продуктивность системы в отношении кислой фосфатазы

4,3 ед акт/1О клеток.

Данные таблицы иллюстрируют выбор оптимальных параметров среды инкубапии, позволяющих достигнуть максимального уровня секреции фосфатазы.

Увеличение концентрации глюкозы и хлористого аммония даже на 15-207, от предлагаемых значений приводит к катаболитной репрессии и резкому снижению (на 70-907.) выхода фосфатазы в среду, а уменьшение содержания субстратов в питательной среде на ту же величину создает дефицит углеродного и азотног о питания клеток, что также отрицательно сказывается на продуктивности биотехнологической системы (секция фермента снижается почти в 2 раза) . Значения рН питательной среды также оптимальны (возможные колебания не должны превышать +0,2 ед. рН). Так например, при работе с иммобилизо— ванными по примеру 1 клетками, но при рН среды 4,7, секреция фосфатазы снижается на 337, по сравнению с оптимальным рН 5,0), а при функционировании иммобилизованных (по примеру 3) клеток при рН питательной среды 5,35 уровень секреции ниже почти на 507.

Концентрация сукцинатного буфера (0,2 M) соответствует необходимому для дрожжевых клеток уровню изотоничности, Данные таблицы и примеры 1-3 по-: зволяют указать оптимальные концентрации субстратов в питательной среде, г/л. глюкоза 20; NH4C1 2;

0,2 М сукцинатный буфер (рН 5 О) до 1л.

Концентрация ПВС в его водном растворе, предназначенном для иммобилизации дрожжевых клеток, составляет согласно предлагаемому способу 5-107. При меньшей (57) концентрации полимера криогель обладает низ= кой механической прочностью, что приводит к значительному вымыванию, клеток из геля. При концентрациях

05972

2,0

5

ПВС в исходном растворе более 10Е получается очень плотный крпогель, что затрудняет диффузию веществ, неблагоприятно сказывающуюся на продуктивности клеток в отношении целевого продукта (опыт показывает, что, например, в случае 137.-ного геля продуктивность клеток снижается на 41%) .

Таким образом, использование пред лагаемого способа позволяет повысить выход целевого продукта в 30-40 раз (от О, 11-0, 14 ед. акт/1О клеток до

3,8-4,3 ед. акт/10 клеток), а также ускорить процесс благодаря повышению длительности непрерывной секреции фосфатазы, а также замене ультрафильтрации на осаждение ацетоном.

Фор мул аизобретени я

Способ получения препарата кислой фосфатазы из дрожжей Saccharomvces

cerevis iae, включающий выделение, биомассы дрожжевых клеток, инкубацию на среде, содержащей глюкозу, источник азота и воду, в условиях, обеспечивающих секрецию кислой фосфатазы в культуральную жидкость и последующее концентрирование целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьянения выхода целевого продукта в расчете на коли— чество дрожжевых клеток и ускорения процесса, инкубации подвергают целые клетки дрожжей, предварительно иммобилизованные в 5-107.-ный криогель поливинилового спирта в реакторе проточного типа на среде, содержащей в качестве источника азота хлохлористый аммоний и дополнительно

0,2 М сукцинатный буфер с рН 5,0, пр и сл ед ующем с о от ноше нии к омп о не нтов, г/л:

Глюкоза 20

Хлористый аммоний

0,2 M сукцинатный буфер с рН 5,0 До1л а целевой продукт концентрируют осаждением охлажденным до (-20) (-30) С ацетоном.

1505972

Продуктивность системы, ед.акт/10 кл, 9

Иммобилинация по

Условия культивирования

Состав питательной среды, г/л

Томпература, С примеру

CD до

1 л,pll

Глюко- 1!!1, С1 эа

СБ - 0,2 И сукцинатны " Фер.

Составитель Л.Иуроиец

Редактор ll. Гулько Техред И, Ходанн r, Корректор Т.Палий

Заказ 5393/27 Тираж 501 Подписное

Б!!1!1!П11 I oñóäàðñòâåèèoãa комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

28

28

?8

28

32

32

32

18

18

17

22

24

21

19

17

18

22

1,8

1,8

1,7

2,2

2,4 ф 1

1,9

1,7

2,0

1,8

2,2

2,0

?,4

4,8

5,2

4,7

5 0

5 0

4,9

5 i

S,0

5,4

5,0

5 0

5,35

4,9

3,35

3,40

2,55

3,50

1,05

3,90

3,80

0,85

2,30

4,00

4,10

2,05

0,45