Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства

 

Изобретение относится к гнбридомнои технологии и может быть использовано для диагностики вируса бешенства (ВБ). Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклональные антитела к нуклеопротеидному структурному белку ВБ. Гибридому получают слиянием мышиных миеломных клеток Sp2/0 с клетками селезенки мышеи Balb/c, иммунизированных ВБ Внуково-12. Мтамм гибридных клеток получил название Крив-Л7 и депонирован под номером ВСКК (II) № 325Ј . Стандартные условия культивирования штамма - среда Дульбекко с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2мМ глютамнна и 50 мкг/мл гентамицина. Частота пассирования через 23сут . Посевная доза 150000 клеток в 1 мл. Кратность рассева 1:2-1:3. Штамм продуцирует МонАТ класса IgG-1, титр МонАТ для культуральной жидкости составляет 1:270 и 1:7290 для асцитной жидкости. МонАТ специфически реагируют с нуклеопротендным белком ВБ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (№1ФА) и непрямой реакции иммуноферментного анализа (ННФА). 1 табл. Ј лека 5ьзхкэ о

„„SU„„1631073

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИ Х

РЕСПУБЛИК

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИ4ЕТЕПЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4679025/13 (22) 13. 02. 89 (46) 28.02. 91. Бюл. II" 8 (71) Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР и Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР (72) С, В. Грибенча, О.В.Василенко, С.И.Клюшник, П.Г.Свешников, И.Ф.Баринский и Е.С.Северин (53) 578.085.23 (088.8) (56) G.Libean et al. "Rev. Elevage

Ied. Vet",, 1984, v. 37(4), р.383-394. (54) ЫТА!й1 П1БРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ HUS MUSCULUS !

1СПОЛЬЗУЕМЬ!П ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К НУКЛЕОПРОТЕИДНОМУ

СТРУКТУРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА БЕ!!!Е1!СТВА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса бешенства (ВБ). Целью изобретения является получение гибридных культи— вируемых клеток животных Mus muscuИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса бешенства.

Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных I1us musculus 1, продуцирующих моноклональные антитела к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства. (Sl)5 С 2 Н 5/00, С 12 Р 21/08

1us I., продуцируюцих мо и оклональные антитела к нуклеопротеидному структурному белку ВБ. Гибридому получают слиянием мьппиных миеломных клеток Брп/О с клетками селезенки мьппей Ва1Ь/c иммунизированных ВБ

Внуково-32. Ытамм гибридных клеток получил название Крив-А7 и лепонирован под номером ВСКК (TI) Р 325 .

Стандартные условия культивирования штамма — среда Дульбекко с 207.-ной эмбриональной телячьей сыворотк ой, 2 MM глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Частота пассирования через 23 сут. Посевная доза 150000 клеток в 1 мл . Кратность рассена 1:2-1:3.

Ытамм продуцирует МонАТ класса IgG-1, титр МонАТ для культуральной жидкос— ти составляет 1:270 и 1:7290 для асцитной жидкости. МонАТ специфически реагируют с нуклеопротеидным белком ВБ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НИФА) и непрямой реакции иммуноферментного анализа (НИФА). 1 табл.

Штамм получают следуюцим обра зам.

Мышиные миеломные клетки Sð /О гибридизуют с клетками селезенки мьш ей Balb/ñ, иммунизированных вирусом бешенс1ва Внуково-32. Гибридные клоны культивируют на селективной среде I AT. С помощью метода:, шмуноферментного анализа (ПФА) и непрямой иммунофлюоресценции (Н»И А) выявляют клоны, продуцируюцие моно1б31073 клоняльные антитела (монЛТ) к нуклеопротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково-32. Путем серийных пассажей клетки одного из наиболее продуктивных клонов выводят в массовую культуру, 111таь1м продуцирует монЛТ на протяжении 13 пассажей (срок наблюдения) .

111тамм получил названйе Крив-А7 и депонировян в специализированной коллекции перевариваемых соматических клеток поз1зоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур в институте цитологии ЛН СССР. r. Ленинграда под номером ВСКК (II) 11. 325Д.

Культуряльные признаки штамма, Стандартные условия культи1зирования — среда Дульбекко с 201 — ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глзотамина и 50 мкг/мл гентами— пина, Характер роста — стационарная суспензия. Петод снятия — встряхи1зание. Частота т1ассирования — через 2-3 сут. Посевная доза

150000 клеток в 1 мл. Кратность рассева 1: 2-1: 3.

Культивирование клеток штамма в ор т янизм1:, живот1нпх .

В Gplclillllую полость мьппсй линии

Вя lb/с, предварительно сенсибнлизироззанных зя 1 — 2 недезп1 внутрибр1ошинной инъекцией 0,3-0,5 мл минерального масла 2, 4, 10, 14 тетраметил— пентадеканом, вводят гибриднь1е клетки. Время образования опухолей 9-.

12 суток, на протяжении 9 пассажей наблюдается 1007 перев ризаемость асцитов.

Морфология клеток штамма.

Кузтт.тура состоит из слабо прикрепля1оптихся к суб грату округлых клеток различной величины с крупныMH ядрами. Цитоплазма 1плеет вид тонкого ободка.

Кариология клеток штамма.

Кяриотип соответствует вигту (мышиный). С помо1Пыо окраски по С-методу определяют три маркерных хромосомы привнесенные в эту линию от роцительс

IOH MHI .IIOMHOII JIHH1III.

Продуктивность п1тяюia.

IIITiIMM гнбридомы Крив-Л7 пр одуцирует моноклональные антитела (монЛТ) к нуклеопротеиду вируса бешенства при культивиротзанин на протяжении 13 пассажей в культуре клеток и 9 пассажей на животных (срок наблюдения) . Титр антител в НИФА для культуральных жидкостей составляет 1: 270 и 1: 7390 для асцитных жидкостей. В реа. ..1.и

П11ФЛ (вяриант отпечатк1 мозга) титр

5 антител равен ь 1; 1200. Концентрация антител в асцитной жидкости 3-5 мг/мл.

Характеристика полезного продукта.

111ь1п1инь1е моноклоналтн. ые а11титела к нуклеопротеидному белку вируса бе10. шенства специфично реагиру1от о н тклеопротеидом вируса в реакции непрямой иммунофлтооресце11ции (Н11ФЛ), а такде в непрямой реакции иммуноферментпогo анализа (НИФА) как R куль— туре клеток, так и в отпечатках головного мозга зараженного бе1пенством животного.

Класс иммуноглобулинов„

111тамм гибридных клеток Крив-Л7 секретирует антите,я класса Тg(; 1.

Криоконсервирование. Клетки КривА7 замораживяют на 8 пассажа.

Об111ее количестг,о ампул 20 по 23 млн клеток, Криозашитная среда с

507. э11бриональной телячьей сыворотки и 107.,11 I(;0-диметн тсульфоксида, Выживаемость при разморажива IHH бО707.

Контаминация. Бактерии, грибы

30 и дро>1 +H Ilp 1зб11аружен11 °

Использование штамма илл1острируется следузо1П1пл примером.

II культуральные матрасы вместимостью 250-500 мл засевают гибрид35 ные к:1етки Крив-А7 в концентрации

100-150 тыс/мл в среде Дульбекко с

207. эмбрионально1л телячьей сыворотки, 2 м11 глютамина, 4 г/л глюкозы и 50 мкг/мл гентамипина. Культуры инкубируют в атмосфере воздуха с

6,3- 7,0Е СО, при 87 С в стационарном состоянии 3-4 сут и используют как образцы кузгьтуральной жидкости (КЖ).

Осадок клеток ресуспенднруют в 1—

1,5 мл среды без сыворотки и вводят по 3-5 MJlll клеток в брюшну1о полость мьпией Вя1Ь/с. Iерез 8-12 сут образуетс я cl цlзтн ая жидк Ость р КО тОрую ис ПОль зуот кяк образцы антител в ясцитной

50 жидкости (А1К) после осаждения клеток, Лктивность моноклональных антител.

Активность монЛТ к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства выявляют непрямым методом иммуноферментног0 анализа с очишенным

55 вирусом бешенства и в реакции непря— мой 1зммунофлюоресценции (Н1ЯА) как в ку:,ьтуре клеток, Tàê и i3 отпечатках ткани головного мозга.

163 1 073

Активность моноклональных ан тел Крив † в реакции непрямой иммуцошлюоресценции с различными штаммами вируса бешенства представлена ь таблице.

Итаммы Внуково-32 и СЧЯ фиксированные, а Як и ОН-5 — уличные штаммы вируса бешенства, Формула изобретения!

lITi

Крив — Л7 первичный

640 640 1280

640 ас пит

Крив-Л7 вторичцыц

w 1280

640 1280

1280 ас цпт

Составитель А.Манык ин

Техред Л.Сердюкова

Корректор H.Äåì÷èê

Редактор Н.Горват

Заказ 523 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, iK-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент, r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

Полученные данные показывают, гт<монАТ Крив-А7 специфически реагируют с внутриклеточными включениями, представленными нуклеопротеидным бе.iком различных штаммов вирусов группы бешенства и не взаимодействуют с

t гликопротеидным белком, расположенным на клеточной мембране. Отсутствие вируснейтрализующей и защитной активности также указывает на специфичность монАТ Крив-А7 к нуклеопро— теидному белку вируса бешенства.

Установлены достаточно выраженная активность моноклональных антител в

Ш1ФА с различными штаммами вирусов группы бешенства (таблцца), а также в реакцци ммуноферментного ана— лиза (1:-40000 в асците и 1:1270 в культуральцой ж едкости) .

Итамм гибридных культивируемых клеток животных 1Us пшзси1цз L, ВСКК (II) ; 3 2"5Р, используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства.