Штамм культивируемых гибридных клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител против альфа- фетопротеина человека

 

li JOOnOTi. ИГ ,: НОСИ ГГЯ К JMnpl-r- ДОМНОП ТОХНОЛОГ Н It МОЖСТ Гм.ГГЬ :,С пользована для определения фетопрота дня в тммуио Ьерчсп гном чстоде. Цель изобретения - почучепне штамма культивируемых гиор д;:их клеток . Ihis mn-culus Lcr пролу- u,ripy:o; iHX моноклокальные антитела (МонЛТ) к альфп-Лсгопротеньу (АФТ) человека и кш отных. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X6J, Ag 3o65J со CTurciioMiiTaMif Mbnjefi с , имму ii m up он an пых очюценкым АФП чслсвока. г амм депонирован под ВСКК It; 3-oOt 1тамм кутьтивчруюг в cpe-u- Mi4 RFMi 1640 с 15% сыворотки чмбриоч.я коровы и стандартными короткожипуп пп добапка 1 при 5« СО2 в яо-тду е. Кдетк1: пересевают каж п..с i-Ь дня с начальной плотностью 1-2 . С 1еткн секретирхют МонАТ класса i,eG1. Гнтр МонДТ в супсрчатантах около 2000. в лсцптинх жидкостях 105 при онреде ICHHH ifi-i-л нофермен гным методом. {Л с:

5 ) (с) ! 0 ток (в)тзуазтьная оцс нка? . Клетки штаь— ма выдерживан)т хранеги)е и при (-70? С. но только до 1 ))ec. Размораживапи= штамма проводят В водя)(ой бане ((!, 37ОС 2-3 мин, после чего клетки отмывают центрифугированием от среды для замораживания и переводят )з обычную культуральную среду.

Характеристика целевого продукта NoHAT, продуцируемых штаммом

С9-84, относится к субклассу Т8Г1., Константа связывания антител штя(". — .

4О ма С9-84 с ЛФП равна 2 О л/м — )иределение проведено жидко-фаз ным ) с "- 5 курентным радиоиммунологическим методом. Взяит)одействие Г!0){ЛТ с ЛФП может бь)ть с)пре;тет(ено в ит.му)(ос()ер— ментном ) радио)тммунолог.:ческом методах, я также в ))0Toifë иммунс изатя.(ос)ореза на Яцетат-це тпюлоз)(ой мембране, смеша! Ной )тре);):;)))тяп:.и: тз геле „

Г!ОНЛТ С9 — 84 связывается с ЛФП,:;нов дящимся в растворе !I )т)(ь(оби.т)изс))зянfhPt НЯ T!IEP j(O)l фаЗЕ Я ТЯ{гГ (1 .t )(25 том сгучяе, когда самo Г!0))ЛТ C9-P. ) прикреплено к ))осите )о, няпримео к пластику. Б "t(тоде;,(зо tliой lii)муно— диффузии тз ге)тг Г!о! ЛТ 09 — i84 Лс!)П {О пред)(питиру()т . I ip )t Я! (Яз! (3 ñ-: с А) p; 3 — 30 личных В и!)ОВ мn()с() пи.«)н)щих . )01!A )

С9-84 реагирует с ЛФП -(OJ(oâå)(я, i()))))II, крысы, собаки, свиньи и кош))t, зя исключением Л(!)П тс Ie)t)(a. ПО ре",ультатам иммунофсрме))т){ого анализа 35

Г!ОНЛТ С9-84 хярактсризус тся o;;ii)l;i— ковым сродст)зом к Л(!)П от бо:) n:,,)3(с. первичным раком пе-.-ci!!l и 7(с)) 1 нального происхождения и бо:(е() н))зким

Срсде ГВОМ К Л(1)П ТЕрЯTOGJ!l! СТС(М )ОГO - (Q происхождения. Испо)тьза)зя)и)е штамма

С9 — 84.

Пример. Пр)(моление 51онЛТ

С9-84 в качестве антителя, конъюгиров анно го с пер оксипяз ой,тля иммуноферментногo определе)(ия Л%1, Для выполнения анализа треб:е тся не менее двух типов Г10НЛТ;;роти(з ЛФП, 50 направленных к двум разным детерми)нантам ЛФП. В данном примере использова— ли (!ОНАТ Е2-84, иммобилизированное на пластике и связывающее ЛФП, а также кон.ьюгат У!ОНЛТ С9-84 с ферментом, проявляющий связавшийся ЛФП, Приготовление кот(ьюгатя на основе Г!0({ЛТ. Очищенную фракцию иммуно! глобуJII()foB )мь)т))п. по г,:-(е() )5ю из яс-I ш(та С9-- -,,;н:-юг)(1;,.i методом с пероксипазой хрен"., ) кя-; с.. е тгзе .— От ii ;- -:.;,с .аль. зуют co!)01)pol3я ()зую н)(и. з!)те ; ",)в()с т()Л() фр ЗКц)т);.I»,t!, )-; O-,» тс)бс -, ); . —. ),))я)(н( ттол чснн" ю 1;»;с(в : 2 i — P4 пс) 1 0) же мета:птке. Белок го (5!зс().с)))ях 0(lpeделяли на слектрсфотомстрс- .

Опрелеление ЛФП )тм)(уно )ермент)ть(м мeTO.:ом провслят на стандартах ЛФП из ком()сзрс(ес,саго:)я боря .

Лнсз»H!(3 )т() а)зо,тят с "ед) ). .)tt) 00" раз )) ).

Б 96 — луночные полис "ироловые

Гт)таты заливают Но 100 "кл очишенной фткр спсц)п) 1Г(му ) о глоб лина;3 F — 84 l3 ко ив

I пентряцш-: 2, ) мкг) м:i я =.;)(5 -ференнссм физиологическом раствор;-. (3 "? pH

i 3 ) . )т)к кс) н (-)з:, — ):1(3c.n t ),. тЕН fiст CО ((1)i;4() t,(0 Л) ) (К, t!) и;, ») (òP ъ, Ва)вт 3ФР, C I)o О ()((,1,"(та с Ti(II 1!т(з »-. тика блокт)руют 200 мк.т С. 5;-ного сыВоpT(>÷í 0 i 0;тл!) б )))!!В.) -(е)(0(3 еl(а НЯ

Зс!)Р— 2 и Г)ри 37" .:, После Гдаления сод(еp))!1!)(to ) o и О;!)(Окп () тна) О пр Оми ва))ия Зс!)Р (3 J(ó))::(:t в,nt HJI() тс(х вносят

1(0 1(0 мк.:i cNcc): )со){ьютятя разведен

НГ! о В (+00 1) я б с (1)е и (1"1 из ес)мме () чес кого ))ябop;i, с к Kii)-)t. . 3 стан,тартов

ы П i) o T;;()J()»(oc ти (О, 2, ), з, 10, 20, 40, 80, 100 и 320 )(гмл1 в соотношени (4 ° (t ))!)1(t G)1))t пт Гт;) Ii 3,l С 1, 5—

2 (-. Сл;тс и). ;)тиос:(Гл)ок у,:({зля)с)т 3 разаа lfp 0) (()))3{тют «",! с: О, О ") ) тв и)тя О H

1 р !(ис тил. )Пр()))Я))1)())) (30.)с)), !1Я

Нос)10))пс t;i i а !1(з if ) (и. я 13 !)у){!() i д() " бавляют и» 1(0() it)t(. i ЯсT))op ) cJбстра Т2 (15 мг а)«то(«е) и .е (;(намина ня 10 мл фс)сйат — ц))трат) О! 0 буфера рН 5,5? и через 30 )ин измеряют Оптическую плотность ряствop(l в кяж )ой .тунке

)три длт)не во (ны 490 нм на с.)тектрофотометре Г1Р 590. Учись)т)тзют среднее значение опти (ескс и плотности для кяжлогo стяндят)тя и ОTp(ят к з HIIOpO вочную кривую, Кон(ьют pp:)B(I))))o(: с. фс рмептом Г!ОНЛТ

С9-84 приго;,но лстя onpcne!ie)(;)я ЛФП

В сочетанш(с . )0))ЛТ 1=2-8 (на гвс р-дой фазе?. Опроце.тяемяя кс нцентрация

ЛФП .тежи-, в ди;-.Пязсн)с 2, 5-320 нг/мл, Ф о р м у л а и з î б р е т е н и я !!!Тамм i(yJ().т)пзируем(;; т )тбрпдных .1()н я)п.; c() с{)» Т, БСКК (II? .". 3480 — про, т) i(0 {т моноклОнальнь)х антител (трот)пз я.)ьфя — фетонротеина человека.