Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства

 

союз советсник социАлистичесних

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОЕ ":.:-: Ге--1М(=Е

И ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬ< =;:У

ГОсудАРстБенный ИОмитет по изоБРетениям и отнрытиям пРи Гннт сссР (21);6 ) 8,3/13

> (З > >j (46) 28. 9. » j . 1»юл. „" 8 (7, 1!)1<- т ь-;т>>т !зи>>>з со !1оги!! .M ..,,(. »1. И!> 1 !

Ов!;, г.;, !(U ССС1 и 1(!!Уч!!ый це"ò-;ð

Ii "> раз,:аботке Инепрс!!!зю современI!!>Г>! М....!!(О!3 МО.. Еl.>»ЛЯPI! il! Д"!!а ГII )С ТIIКИ (, 2 С, B: > »бе::!а, В,A. Фурале!з,,(!1„.. !ю;:;.,:: I „Г.Свешников. .,> »;;; », —. -, -» »;:, ((:-,>е»>!III, . 3,, ::», 1";.23 (088,8)

"> ((с.1» . з!» 198А, ч. 37 (), р,383-394. "-,. ) i(Л ;Ы! (111»1=| 1Д(11>ЕК КУ (ЬТИВИРУ(»ЫК з " 10. (! (!»!11>((!(US (>I(JSCULUS

>1 !!>";1-,3У(„ т,((! Г(!1Я (10:!У!(Б 1111с((1011(1К::10, 1 Рj(j I(ТЕ: :I K (!1111(0(11»ОТЕ.ИДЕ(01 (У

;, !»:>„--,;РЕ!Р*,;У !;1-)ГЕКУ ВЦ(>УСЛ ББ "1811 Т!ЕЛ

t 11зобретеl!ие. Относится к гибри,Омно технологии и может быть иси!! 1::..зовано д:я диагностики в!!руса беш.>!!ство (ВБ) . Целью изобретения явля ет . я Ilo.>I»» !ных

Г(зоо1зетeIIие ОтнОсится к Гибридоы—

lIc2A ехноло гни и может быть использовано для диагностики вируса бешенC "> I> а (Еел:,ю изобретения является голуче>.ие нlт»1мм»» гибридных культ!!Вируемых клеток, !Тро(1уц!!руюн!Их моноклональные

;„Iò 1тел=" к гликопротеидному структурiIò.;> бслку вируса бешенства (ВБ).

;(т!1ь !.! получают следующим образом.

> ышиные миеломные клетки Sp /0 . ибрицилирую- с к !етками селсзе:!ки

>>1!» C >> N >>>OD > .12 Р 2 tÑß культ>1виръ емых клеток, продуцирую!них моноклональные антитела к гликопроте: дному структурному белку ББ, Гибpèäîìó получают слиянием !!ышиных миеломных кле":îê Бр/О с клетками селезенки мьнпей Ва1Ь/с, иммунизированных ВБ Внуково-32. Штамм гибридных клеток получил название Крив-f C5 и 1с 11oIIIqIni»ан под номером ВСКК (П)

1(- 320D. Стандартные условия культивиро!1!!ия н!Тамма — среда Дульбекко с

207-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 м("(глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. 1(астота пассирования через 2-3 сут, посевная доза.

150000 клеток в 1 мл. Кратность рассева 1: 2 — 1: 3. Штамм продуцирует

1(онАТ класса IgG изотипа 2а, титр

1(ОИЛТ в Е(ИФЛ для культуральной жидкости 1:810 и в асците 1:65610.

ИонЛТ спе!впн1!чно реагируют с гликопротеидом ВБ в реакц!п1 непр лой иммуыофлюоресценцпи (ЕЕ(1ФЛ) и непрямой реакции !г.!!уноферме!!тного аиализа (НИФА) . мышей Ва1Ь/с, !гамунизированных вирусом бешенства Внуково-32. Гибридные клоны культивируют на селективной среде ГЛТ. С помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлюоресценции выявляют клоны, продуцирующие моноклональные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково-32, Путем серийных пасса:;cei клетки одного из наиболее продуктивных клонов выводят в массовую культуру. Шта.нч

1631072 продуцирует моноклональные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково-32 на протяжении 17 пассажей (срок наблюдения).

Итамм получил название Крив-1-05 и депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматичес-ких клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур в Институте цитологии AH СССР г.Ленинград под номером ВСКК(П) № 320D., Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования — среда Дульбекко с 207.-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина, Характер роста — стационарная суспензия. Метод снятия — встряхивание.

Частота пассирования — через 2-3 сут, Посевная доза — 150000 клеток в 1 мл.

Кратность рассева — (1:2) †(1:3).

Культивирование в организме животных.

В брюшную полость мышей линии

ВаТЬ/с, предварительно сенсибилизированных за 1-2 недели внутрибрюшинной инъекцией 0,3-0,5 мл минерального масла 2, 4, 10, 14 тетраметил/ пентадеканом, вводят гибридные клетки. Время образования опухолей 912 сут; на протяжении десяти пассажей наблюдается 100%-ная перевиваемость асцитов.

Морфология клеток.

Культура состоит из слабо прикреп— ляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами, Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Кар иология .

Кариотип соответствует виду (мышиный). С помощью окраски по С-методу три маркерные хромосомы, привнесенные в эту линию от родительской миеломной линии.

Продуктивность штамма.

Итамм гибридомы Крив-1-С5 продуцирует моноклональные антитела к гликопротеиду вируса бешенства при культивировании на.протяжении семнадцати пассажей в культуре клеток и десяти пассажей на животных (срок наблюдения). Титр антител в НИФА для культуральных жидкостей составляет 1:810 и 1:65610 для асцитньгх жидкостей. В реакции нейтрализации на мышах титр антител равен > 1:500. Кон10

55 центрация моноклональннх ai т:-ггел в асцитной жидкости 4-6 мг/мл, Характеристика полученного продукта.

Мышиные моноклональные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства специфично реагируют с гликопротеидом вируса беше"c.òãà в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НМФА), реакции нейтрализации на мышах и непрямой реакции иммуноферментного анализа (НИФА), Класс иммуноглобулинов.

Ытамм гибридных клеток Крив-1-С5 секретирует антитела класса IgG изо-. тип 2а.

Крноконсервирование. Клетки Крив1-С5 замораживают на десятом пассаже °

Общее количество ампул — 20 по 23 млн„клеток. Криозащитная среда с

507.-voé эмбриональной телячьей сыво— роткой и 107-ного Д1СО-диметилсульфоксида. Выживаемость при размораживании 60-707.

Контаминация.

Бактерии, грибы и дрожжи не об— наружены.

Использование штамма.

В культуральные матрасы вместимостью 250-500 мл засевают гибридные клетки Крив-1-С5 в концентрации 100150 тыс/мл в среде Дальбекко с 207ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 4 г/л глюкозы и

50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют в атмосфере воздуха с 6,27,0Х С0 при 37,С в стационарном состоянии 3-4 сут и используют как образцы культуральной жидкости (КЖ).

Осадок клеток ресуспензируют в 1—

1,5 мл среды без сыворотки и вводят

3-5 млн клеток в брюшную полость мышей Bulb/с. Через 8 — 12 сут образуется асцитная жидкость, которую используют . как образцы антител в асцитной жидкости (АБ) после осаждения клеток.

Активность моноклональных антител (монЛТ).

Лктивность МонАТ к гликопроидному структурному белку вируса бешенства выявляют непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) с очищенным вирусом бешенства и очищенным гликопротеидом, в реакции непрямой иммуно-флуоресценции (НМФЛ); в реакции нейтрализации на мышах, в защите мышей от ь 3200 LD> вируса бешенства, введенного в мозг, а также в выраженном

107"

Формула изобретения

Составитель А.ваныкин

Техред Л.Сердюкова

Корректор Н.Ревская

Редактор Н.Горват

Заказ 523 Тираж 372 Подписное

В11ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. /5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 163 терапевтическом эффекте предварительно зараженных животных. В ИФА титры антител варьируют 5-15 млн.

Полученные данные показывают чт что

МонАТ Крив-1-С5 специфически реаги руют с гликопротеидом различных штам— мов вируса бешенства и не взаимодействуют с внутриклеточным нуклеопротеидом.

Установлено, что только антитела к гликопротеипу обладают вируснейтралиэующим и защитным действием к вирусу бешенства.

Таким образом, полученная гибридома секретирует монЛТ к основной функционально-значимой детерминанте

5 гликопротеида вируса бешенства.

Итамм гибридных культивируемых; клеток животных lfus musculus L. ВСКК (II) K 320D, используемый для получения моноклональных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства.