Способ получения иммобилизованного кардиолипинового антигена для определения специфических антител
Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии и иммунодиагностике, и может применяться в ревматологии, кожно-венерологической практике и других областях медицины. Для получения иммобилизованного кардиолипинового антигена для определения специфических антител производят обезвоживание полиакриламидных гранул с магнитными свойствами, высушивание и инкубацию их со спиртовым раствором кардиолипинового антигена в соотношении 1: 20 при перемешивании до полного выпаривания растворителя. Затем целевой продукт отмывают 0,1 М фосфатным буфером ( рН 7,4) с 0,05%-ным раствором детергента Твин-20. Предлагаемый способ позволяет получить дешевый и технологически удобный препарат.
Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии и иммунодиагностике, м может применяться в ревматологии, кожно-венерологической практике и других областях медицины. П р и м е р 1. В 2 мл физиологического раствора растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида. В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2 1,0 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл забуференного раствора ( рН 7,4) с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония. Через 1 2 мин добавляли 2 мл физиологического раствора с растворенными мономерами акриламида и 20 мкл N,N,N', N'-тетраметилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации в течение 10 15 мин гранулы отмывали ацетоном и ЗФР с Твином-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров акриламида, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10 100 мкм. Обезвоживание проводили абсолютным этиловым спиртом 2 раза по 20 мин и один раз охлажденным до -30oС ацетоном (в течение 2 ч). После этого гранулы высушивали при комнатной температуре. 320 мг сухих полиакриламидных гранул с магнитными свойствами помещали в раствор кардиолипинового антигена. Смесь ставили на магнитную мешалку и инкубировали до полного выпаривания растворителя при 37oC в термостате. После этого гранулы отмывали от свободного кардиолипина 3 раза по 10 мл ЗФР с 0,05% Твином-20. В промывном растворе определяли общую концентрацию антигена по Лазарову. Процесс сорбции кардиолипинового антигена на носитель осуществляли при 37oC в соответствии с "Инструкцией по использованию кардиолипинового антигена". При температуре ниже 37 oC в антигене возможно выпадение кристаллов холестерина, одного из трех компонентов кардиолипинового антигена. Оптимальное соотношение гранул и сорбента 1:20 определено экспериментально. Для этого постоянное количество гранул (50 мг) обрабатывали, инкубировали с разным количеством кардиолипинового антигена, после чего определяли концентрацию липидов по Лазарову в отмывающей жидкости, общий объем которой на каждую партию гранул составил 15 мл (т.е. определяли несвязавшийся кардиолипиновый антиген). Фосфатно-солевой буфер ( рН 7,4) используют в работе исходя из того, что реакция антиген антитело обладает высокой чувствительностью к рН и оптимально протекает при нейтральных значениях рН. В биологических системах постоянная величина рН поддерживается с помощью эффективных буферных систем. Большинство буферных систем, содержащихся в физиологических жидкостях, включаеют фосфаты, бикарбонаты и т.д. С учетом вышеизложенного и данных литературы наиболее оптимальным физиологичным будет фосфатно-солевой буфер с нейтральным значением рН 7,4. При этом гранулы после отмывки уже готовы для проведения иммунологических реакций и не требует дополнительных манипуляций. Для отмывки от непрореагировавших мономеров акриламида, эмульгатора и не включенного биологически активного вещества, гексана, используют 0,05% Твин-20, который является неионным детергентом и применяется при постановке иммунологических реакций. Он снижает неспецифическую сорбцию и практически не влияет на специфическое взаимодействие. Твин-20 используется в работе ввиду наименьшего содержания в его составе лауриновой кислоты (55%), которая может влиять на исход реакции (Твин-80 75% лауриновой кислоты, Твин-40 90% лауриновой кислоты). П р и м е р 2. Выявление антикардиолипиновых антител иммунофлюоресцентным методом с использованием иммобилизированного гранулированного антигена с магнитными свойствами. Для отмывки от консерванта в лунке планшета вносили 0,5 мл ЗФР и добавляли 20 мкл 10%-ной взвеси гранул, физиологический раствор отсасывали и затем вносили 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:4 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого сыворотку удаляли и гранулы трижды промывали ЗФР. Выявление специфических антител осуществляли коммерческой видовой люминесцирующей сывороткой. После инкубации 30 мин при комнатной температуре гранулы отмывали в последовательности, описанной выше. Выявление уровня свечения микрогранул осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И-3, снабженного фотометрической приставкой ФМЭЛ-1А. Предметное стекло с фиксированными на нем гранулами устанавливали на столике микроскопа и находили их в поле зрения объектива. Выбранный зонд (0,5) фотометрической насадки совмещали с фотометрируемым участком гранулы и при максимально закрытой полевой диафрагме снимали цифровое значение флюоресценции гранул на вольтметре. Высчитали среднее значение свечения 6 гранул, а также среднее значение флюоресценции фона. Разница свечения гранул и фона выражается в относительных единицах флюоресценции (мВ) и характеризует свечение препарата. Положительной считают интенсивность флюоресценции гранул, достоверно отличающуюся от интенсивности контрольных препаратов. При отсутствии фотометрической насадки интенсивность свечения можно измерять классическим методом по 4-балльной системе. Для повторного использования гранул проводят предварительную десорбцию иммуноглобулинов растворов с высокой ионной силой 3 М NaCNS или 0,1 М глицерин НСl буфером (рН 2,2) с последующей отмывкой ЗФР до нейтрального значения рН или до отсутствия ионов СNS-, наличие которых проверяли качественной реакцией с 5%-ным раствором FeCl3. П р и м е р 3. Проверка специфичности препарата. После обработки сывороткой больного иммобилизированный гранулированный антигенный препарат обрабатывали неиммунной флюоресцирующей нормальной сывороткой. Специфического свечения не отмечалось. После обработки препарата сывороткой донора с последующей окраской флюоресцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека специфического свечения не отмечалось. Иммобилизированный гранулированный кардиолипин обрабатывали сывороткой больного (заведомо положительной), а затем кроличьей против иммуноглобулинов человека сывороткой, не открашенной ФИТЦ. После промывания препарата снова обрабатывали гомологичной, но уже флюоресцирующей антисывороткой отмечали слабое специфическое свечение. Заведомо положительную сыворотку адсорбировали иммобилизированным гранулированным кардиолипиновым антигеном, затем активность данной сыворотки проверяли в реакции микропреципитации и на гранулах специфического свечения. П р и м е р 4. Проверка чувствительности иммобилизированного гранулированного каридолипинового антигена. Для проверки чувствительности предлагаемого иммобилизированного антигена использовали 20 заведомо положительных сывороток больных сифилисом (на ++++). С предварительно раститрованными сыворотками (1:2-1:2048) ставили реакцию микропреципитации с обычным коммерческим кардиолипиновым антигеном, и иммунофлюоресценции с иммобилизированным гранулированным кардиолипином. В реакции микропреципитации титр сыворотки был в пределах 1:32 1:64, в то время как в реакции иммунофлюоресценции 1:256 1:1024. П р и м е р 5. Определение антикардиолипиновых антител у больных сифилисом. Постановка реакции иммунофлюоресценции проводится по методике, описанной в примере 4, в качестве исследуемой использовалась сыворотка больных сифилисом. Контроли реакции описаны в примере 5. Уровень флюоресценции контрольных препаратов составлял 3 10 мВ, интенсивность специфического изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных сифилисом, от 20 мВ и выше. Антикардиолипиновые антитела выявлены в 100% случаев, что коррелирует с данными литературы. П р и м е р 6. Определение антикардиолипиновых антител у больных системной красной волчанкой. Постановка реакции иммунофлюоресценции проводится по методике, описанной в примере 2, в качестве исследуемой использовалась сыворотка больных системной красной волчанкой. Контроль реакции описан в примере 3. Уровень флюоресценции контрольных препаратов составлял 3 10 мВ, интенсивность специфического изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных системной красной волчанкой, от 20 мВ и выше. Антикардиолипиновые антитела выявлены в 100% случаев, что коррелирует с данными литературы. П р и м е р 7. Определение антикардиолипиновых антител у больных системной склеродермией. Постановка реакции иммунофлюоресценции проводится по методике, описанной в примере 2, в качестве исследуемой использовалась сыворотка больных системной склеродермией. Контроли реакции описаны в примере 3. Уровень флюоресценции контрольных препаратов составлял 3 10 мВ, интенсивность специфического изумрудно-зеленого свечения гранул, обработанных сывороткой больных системной склеродермией, от 20 мВ и выше. Антикардиолипиновые антитела выявлены в 100% случаев, что коррелирует с данными литературы. Создание иммобилизированного гранулированного кардиолипинового антигенного препарата с магнитными свойствами позволяет повысить чувствительность метода определения специфических антител за счет концентрирования коммерческого препарата и его перевода в иммобилизированную форму с применением высоко чувствительных иммунологических методов таких, как иммунофлюоресцентный, иммуноферментный и радиоиммунный. Предлагаемый иммобилизированный антиген кардиолипин может найти применение в кожно-венерологической и ревматологической практике. Предлагаемый иммобилизированный гранулированный кардиолипин с магнитными свойствами возможно неоднократно использовать и длительно хранить без потери активности антигена. Использование предлагаемого метода позволяет получить дешевый и технологически удобный препарат, с помощью которого можно автоматизировать процесс постановки реакции.
Формула изобретения
Способ получения иммобилизованного кардиолипинового антигена для определения специфических антител, включающий обезвоживание полиакриламидных гранул с магнитными свойствами, высушивание и инкубацию их со спиртовым раствором кардиолипинового антигена в соотношении соответственно 1:20 при перемешивании до полного выпаривания растворителя, после чего целевой продукт отмывают О, 1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 0,05%-ным раствором детергента Твин-20.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000
Извещение опубликовано: 20.03.2000
