Способ проведения иммуноферментного анализа

 

Изобретение относится к медицине, а именно к определению концентрации био- ЛОГИЧРСКИХ вещестр иммуноферментным анализом Цель изобретения - повышение чувствительности анализа Сенсибилизируют подложку инкубируют с исследуемыми Пробами затем отмывают подложку и вносят меченый коньюгат После добавления субстрата дополнительно вносят крахмал до концентрации 007-008% а непосредственно перед измерением ионов иода подложку прогревают при 60 70°С По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность анализа в 100 раз

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ts»s 6 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ . (21) 4686889/14 (22) 03.05.89 (46) 07,06.91. Бюл. Мт 21 (71) Самаркандский государственный медицинский институт им. И.П.Павлова (72) P.À.Ñèãäûêîâ, Д.М.Ивницкий, Л.С.Рейфман и В.Е,Курочкин (53) 615,374 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1205913, кл. 6 01 N 33/53, 1985, (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, сельскому хозяйству, в частности к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ в различных средах, и может быть использовано на предприятиях медицинской, биотехнологической, пищевой промышленности.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Электрохимическое определение фермента-маркера осуществляют по молекулярному йоду. — продукту пероксидазного окисления йодид-ионов перекисью водорода при рН 3,8 — 4,2 в присутствии 0,07 — 0,08 крахмала, с последующим разрушением комплекса крахмал-йод прогреванием при

60-70 С непосредственно перед измерением.,, Ы2„„1654750 А1 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к определению концентрации биологических веществ иммуноферментным анализом. Цель изобретения — повышение чувствительности анализа. Сенсибилизируют подложку, инкубируют с исследуемыми пробами, затем отмывают подложку и вносят меченый коньюгат. После добавления субстрата дополнительно вносят крахмал до концентрации 0,07-0,08%. а непосредственно перед измерением ионов иода подложку прогревают при 60-70 С. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность анализа в 100 раз, Пример 1. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 200 мкл 1-глобулиновой фракции кроличьей антисыворотки против L-аспарагиназы, содержащей 20 мкг/мл белка, на фоне 0,01 моль/л фосфатного буфера (рН

7,4), йнкубируют 2 ч при 37 С, лунки промывают 4 раза 0,01 моль/л фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 моль/л хлористого натрия и 0,05% тритона Х-100.

Затем вносят в лунки по 200 мкл растворов с различным содержанием коньюгата L-аспарагиназа-пероксидаза на фоне промывочного буфера, инкубируют в течение 1 ч при 37 С. После чего повторяют операцию промывки 5 раз, вносят по 200 мкл субстратной смеси, содержащей 0,75 ммоль/л йодистого калия, 0,3 ммоль/л перекиси водорода и 0,07% крахмала на фоне 0,1 моль/л ацетатного буфера, рН 4,1, инкубируют 50 мин при комнатной температуре. Регистрацию результатов проводят после инжекции 100

16!4750

Формула изобретения

Составитель В.Литовченко

Техред М.Моргентал Корректор M.Øàðoøè

Редактор В.Данко

Заказ 1948 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 мкл пробы в проточную линию амперометрического датчика. Температуру проточной линии и датчика устанавливают равной

70 ч-0 5 С

Пример 2. Определение проводят прямым методом связывания. Для этого в лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 200 мкл у-глобулиновой фракции кроличьей антисыворотки против L-аспарэгиназы, содержащей 20 мкг/мл белка на фоне 0,01 моль/л фосфатного буфера (рН 7,4), инкубируют 2 ч при 37 С. Лунки промывают 4 раза

0,01 моль/л фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 моль/л хлористого натрия и 0,05;4 тритона Х-100. Затем вносят в лунки по 200 мкл растворов с различным содержанием коньюгата L-аспарагиназа-пероксидаза на фоне промывочного буфера, инкубируют 1 ч при 37 С. Операцию промывки повторяют 5 раз. Затем вносят по 200 мкл субстратной смеси, содержащей 0,75 ммоль/л йодистого калия, 0,3 ммоль/л перекиси водорода и 0,08 /, крахмала на фоне 0,1 моль/л эцетатного буфера (рН 4,1), инкубируют 50 мин при комнатной температуре.

Регистрацию результатов проводят после инжекции 100 мкл пробы в проточную линию амперометрического датчика. Температуру проточной линии.и датчика устанавливают равной 60 0,5 С.

Статистически установлено (по t-критерию Стьюдента при P = 0,95), что нижний предел определения коньюгата предлагаемым методом равен 8 10 моль/л (1,0 нг/мл) по 1-аспарагиназе, по известному способу 1 10 моль/л (13,0 нг/мл), Таким образом, предлагаемый способ

5 обеспечивает значительное повышение чувствительности иммуноферментного BHBIIMза с электрохимической детекцией как по ферменту-маркеру (с 1 10 до 6 ° 10 моль/л, так и по меченому антигену (c

10 1 ° 10 до 8 10 моль/л), т.е. в 100 раз по сравнению с известным способом.

Использование предлагаемого метода позволит проводит иммуноферментный анализ различных физиологически актив15 ных соединений, при наличии иммунопероксидазных диагностикумов с высокой чувствительностью. При этом становится возможным расширить круг определяемых объектов, содержание которых в анализиру20 емых средах составляет пикомоли.

Способ проведения иммуноферментно25 ro анализа, включающий сенсибилиэацию подложки. инкубацию с меченым коньюгатом, отмывку с последующим добавлением субстрата и измерением ионов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения

30 чувствительности способа. после добавления субстрата дополнительно вносят крахмал в концентрации 0,07 — 0,08;6, а перед измерением ионов подложку прогревают до

60 †70.