Способ оценки активности b-клеточного дифференцировочного фактора

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для исследования биологических материалов в лабораторно-клинической практике. Цель изобретения упрощение способа. Для этого в качестве тест-системы для оценки активности В-клеточного дифференцировочного фактора используются В-клетки больных в 3- и 2-й стадиях, осложненных анемическим синдромом хронического лимфолейкоза. Об активности фактора судят по усилению секции иммуноглобулинов с помощью иммуноферментного анализа.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для исследования биологических материалов в лабораторно-клинической практике. Цель изобретения упрощение способа. Способ осуществляется следующим образом. Из периферической крови больных В-ХЛЛ 3 и 2, осложненной анемическим синдромом, стадиями выделяют мононуклеары (МК) центрифугированием гепаринизированной венозной крови (5 мл, содержащей 500 ЕД гепарина) в градиенте плотности фиколлаверографина (3 мл, плотность 1077). Выделение сепарированных В-лимфоцитов проводят на 20 мл колонках с нейлоновым волокном (0,1 г волокна на 1 мл объема колонки). Полученные В-лимфоциты (1х10⁵ лунку) культивируют в круглодонных лунках планшетов для иммунологических исследований в среде RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл 1-глютамина, 2 мМ HEPES-буфером, 100 мкг/мл гентамицином и 10% фетальной телячьей сыворотки теленка (FCS, FLow) при 37^оС и СО₂-инкубаторе. В качестве источника В-клеточного дифференцировочного фактора можно использовать супернатанты МК здоровых доноров, полученные путем инкубации лимфоцитов в течение 48 ч с ФГА в дозе 1:1000 в аналогичной культуральной среде. Фетальная телячья сыворотка в последнем случае составляет 1% Указанный супернатант (С_ФГА) добавляют в культуры В-клеток в концентрации 33% Секрецию иммуноглобулинов оценивают иммуноферментным методом. Для этого 96-луночные, плоскодонные планшеты (FLow) обрабатывают раствором бараньих антител против IgM человека (10 мкг/мл) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) в объеме 0,1 мл/лунку в течение 4-5 ч при 37^оС во влажной атмосфере. Далее планшеты троекратно отмывают от несвязавших с пластиком анти-Ig антител фосфатзабуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2). Для предотвращения неспецифического связывания планшеты обрабатывают блокирующим раствором (1% -ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БCA, Sigma) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) объеме 0,2 мл/лунку в течение 16-18 ч при 4^оС во влажной камере. После этого планшеты троекратно отмывают раствором 0,05% твина (Твин 20). Исследуемые культуральные супернатанты разводят 1: 4 забуференным физиологическом раствором, содержащим 0,05% Твин 20, перед внесением в лунки планшетов для иммуноферментного анализа. Одновременно готовят калибровочные разведения эталонной сыворотки человека (от 1600 нг/мл до 12,5 нг/мл для иммуноглобулинов класса М) в аналогичном растворе. Супернатанты и эталонную сыворотку вносят в объеме 0,1 мл/лунку и инкубируют 1-2 ч при 37^оС. Планшеты отмывают 5 раз 0,05%-ным раствором Твин 20. В лунки вносят конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против IgM человека (0,1 мл/лунку) в разведении 1:1000. Инкубацию проводят при 37^оС в течение 1-2 ч. Планшеты отмывают 10 раз 0,05% Твин 20. Ферментативную активность пероксидазы в образовавшихся комплексах определяют добавлением в лунки по 0,1 мл субстратного раствора, приготовленного следующим образом: 1,2 фенилдиамин (10 мг на 1 мл метилового спирта) разводят в 0,05 М цитратном буфере (рН 4,6) в пропорции 1:99 и к 100 мл указанной смеси добавляют 0,01 мл 33%-ного раствора перекиси водорода. После инкубации в течение 10-15 мин при комнатной температуре останавливают цветовую реакцию добавлением в лунки по 0,05 мл 50% серной кислоты. Фотометрию проводят на аппарате Титертек Мультискан (FLow) при длине волны 472 нм. Об активности дифференцировочного фактора судят по индексу влияния (ИВС_ФГА), рассчитанному по формуле Пределы числовых значений параметров определяются точностью аппаратуры, пригодной для медицинских целей. П р и м е р. Сравнение активности В-КДФ в супернатантах ФГА-стимулированных МК двух здоровых доноров. В качестве тест-системы использованы В-клетки больного А. 56 лет с диагнозом ХЛЛ, 3 стадия, гепатоспленомагалический синдром, осложненный анемическим и тромбоцитопеническим синдромами, прогрессирующее течение. Клинически у больного были обнаружены увеличенные лимфоузлы (до 3 см), пальпировалась увеличенная печень (на 3 см ниже края реберной дуги). Анализ крови показал наличие анемии (эритроциты 2,9 х 10¹²/л), лейкоцитоз (35 40х10⁹/л) с выраженным лимфоцитозом (94% лимфоцитов). В присутствии С_ФГА донора 1 ИВ-3,8, что свидетельствует о наличии активности В-КДФ в указанном супернатанте. При оценке активности В-КДФ в С_ФГА донора 2 активность дифференцировочного фактора не выявляется (ИВ=0,8). Способ упрощает получение тест-системы, а также позволяет повысить чувствительность способа путем замены метода бляшкообразования на иммуноферментный анализ.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ B-КЛЕТОЧНОГО ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ФАКТОРА путем измерения показателей интенсивности дифференцировки B-лимфоцитов в тест-системе, с последующей оценкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве тест-системы используют культуру клеток B-лимфоцитов больных B-клеточным вариантом хронического лимфолейкоза в 3 и 2 стадиях, осложненных анемическим синдромом, а интенсивность дифференцировки оценивают по количеству секретируемых иммуноглобулинов методом иммуноферментного анализа.