Способ определения антител к миокарду

 

Изобретение относится к медицине , касается диагностики аутоиммунного поражения миокарда. Цель изобретения - упрощение способа. Для этого из сердечной ткани эмбриона человека готовятгомогенат, который фрикционируют методом дифференциального центрифугирования при 45000- 50000 об/мин. После обессоливания супернатанта проводят гель-фильтрацию на колонке сефадекса С-75 для выделения высокоочищенной белковой фракции миокарда, которую помещают в пробир ,ки и инкубируют 1,5 ч, затем пятикратно отмывают фосфатным буфером ;(рН 7,2) и 0,05%-ным р-ром Твин-20. В пробирки после отмывки добавляют 1%-ный р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА). Контрольную группу проI бирок заполняют только р-ром БСА. Затем вновь проводят инкубацию и отмывку в аналогичных условиях. Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного при трех разведениях сыворотки - 1:10,1:100, 1 :1000. В отмытые пробирки опыта и контроля добавляют сыворотку крови кролика с антителами к иммуноглобулинам человека в разведении 1:1000. Вновь проводят инкубацию и отмывку и вносят сыворотку свиньи с антителами к иммуноглобулинам кролика , меченную пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации и отмывки в пробирки вносят субстратную систему ABTS и HgOj,, вновь инкубируют 25 мин, добавляют р-р азида натрия для блокирования цветной реакции, оценивают степень окраски спектрофотометрически при / 650 нм. По интенсивности развивающейся цветной реакции твердофазным иммунньш методом определяют противокардиальные антитела. (Л о ч ю

союз советсних социАлистичесних

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1

1511 4 G 01 N 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТНЕННЫИ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4003502(28-14 (22) 27.12,85 .(46) 23.07.88 Бюл. 1Ф 27 (71) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого главного управления при Министерстве эдравоохранения СССР (72) Ю.И.Зймин, А.В.Сумароков, С.Н.Москвина и С.E.Òåðåøåíêo (53) 615.373(088.8) (56) Белгарян А.А., Сумароков А.В., Лямперт И.Т. — Тер.арх., 1980, Р 6, 80-84. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

МИОКАРДУ (57) Изобретение относится к медицине, касается диагностики аутоиммун" ного поражения миокарда. Цель изобретения — упрощение способа, Для этого иэ сердечной ткани эмбриона чело" века готовят гомогенат, который фрикционируют методом дифференциального центрифугирования при 4500050000 об(мин. После обессоливания супернатанта проводят гель-фильтрацию на колонке сефадекса G-75 для выделения высокоочищенной белковой фракции миокарда, которую помещают в пробир,ки и инкубируют 1,5 ч, затем пятикратно отмывают фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,053-ным р-ром Твин-20, В пробирки после отмывки добавляют

1%-ный р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА). Контрольную группу про бирок заполняют только р-ром БСА. 3атем вновь проводят инкубацию и отмывку в аналогичных условиях, Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного при трех разведениях сыво" ротки — 1: 10, 1: 100, 1: 1000. В отмытые пробирки опыта и контроля добавляют сыворотку крови кролика с антителами к иммуноглобулинам человека в разведении 1:1000, Вновь проводят инкубацию и отмывку и вносят сыворотку свиньи с антителами к иммуноглобулинам кро" лика, меченную пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации и отмывки в пробирки вносят субстратную систему

ABTS и Н О, вновь инкубируют 25 мин, добавляют р-р азида натрия для блокирования цветной реакции, оценивают степень окраски спектрофотометрически при Я = 650 нм. По интенсивности развивающейся цветной реакции твердофаэным иммунным методом определяют противокардиальные антитела.

1411672

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике аутаиймунного поражения миокарда.

Целью изобретения является упроще-! ние способа.

Способ осуществляют следующим обaS0M °

Из сердец 25 эмбрионов человека возрасте 20-24 недель готовят гомо- енат, который фракционируют методом дифференциального центрифугирования ри 45000-50000 об/мин, Необходимая елковая фракция при данной частоте ращения остается в супернатанте, а ри большей осаждается на дне пробири вместе с другими белковыми фракиями. После обессоливания супернааита проводят гель-фильтрацию на коонке сефадекса G-75 .для выделения

ысокоочищенной белковой фракции миоарда с молекулярной массой 250005000, что соответствует массе клеочных мембран кардиомиоцитов Полуенный антиген миокарда (белок мемб- 25 ан кардиомиоцитов) имеет морфологиескую (в том числе и антигенную) труктуру, идентичную миокарду взросого человека. Плод считается жизнепособным в возрасте свьппе 28 неель, а к 20 неделе развития уже полостью формируются элементы сердечноосудистой -системы, Использование эмбрионального антигенного материала миокарда является наиболее благоприятным, так как миокард эмбриона, зятый сразу после его гибели, ие подвергался воздействию вредных аген1гов, способных влиять на антигенную структуру кардиомиоцитов. Полученный 40 нтиген миокарда не содержал миогло ин (мол.масса 17600), что было под гверждено при радиоиммунологическом исследовании с набором антител к

Миоглобулину Atomique Nucleare. Для 45 вязывания антигена миокарда с твердой фазой (внутренней поверхностью цолистироловой пробирки) в полисти оловые пробирки помещали раствор анТигена миокарда в концентрации

35 мкг/мл, Данная концентрация антигена является наиболее оптимальной, гак как использование концентраций антигена 12,5 мкг/мл и меньше существенно снижает чувствительность способа, тогда как при применении концент55 рации антигена миокарда 50 мкг/мл и больше заметно не повышает чувствительность способа, а расход ценного реактива - антигена миокарда - значительно увеличивается, Пробирки инкубируют в течение 1,5 ч при Э7 С во влажной среде, содержащей 5 . СО .

При инкубации более 2 ч чувствитель" ность способа повышается незначительно, а при инкубации менее 1 ч отмечено значительное снижение чувствительности метода. Температурный режим и уровень концентрации С0 соответствуют внутренней среде живого ор ганизма и наилу ппим образом влияют на кислотно-щелочное равновесие используемых растворов.

После ннкубации проводят пятикрат. ную отмывку фосфатным буфером (рН

7,2) и 0,05Х-ным раствором Твин-20 для уменьшения неспецифического свя" зывания белков, Пять последовательных отмывок достаточно для полного удаления из пробирок реактивов, участ вовавших в предыдущем этапе исследования. После этого в пробирки добавляют 1Х-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, обеспечивающего полное закрытие оставшейся свободной поверхности полистирола, способного участвовать в неспецифической сорбции белков. Использование альбумина в концентрации меньше 1Х не обеспечивает полного закрытия полистироловой поверхности, что в значительной мере снижает специфичность способа, а при применении концентрации альбумина больше 1,5Х существенно не влияет на специфичность способа и приводит к большему расходу реактива (альбумина). Эти данные получили при использовании альбумина в интервалах концентрации от 0,05 до 2, Параллельно формируют контрольную группу пробирок, численно равную опытной, которые заполняют только указанным раствором альбумина, Все пробирки инкубируют и отмывают в указанных условиях. Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного, формируя три разведения сыворотки 1:10 1:100 и 1:1000, которые вносят в три пробирки из контрольной и три пробирки из опытной групп, создавая серию из шести пробирок, соответствующую каждому больному. Указанные пробирки инкубируют и отмывают в указанных условиях.В отмытые пробирки добавляли сыворотку крови кролика, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека, в разведении 1:1000. Данное разведение сывоз

1411672

4 ротки является наиболее оптимальным ментного способа на наличие антител для увеличения чувствительности и спе- к миокарду, B качестве контроля исцифичности способа, Инкубацию н от- пользовали сыворотку, полученную иэ мывку проводят в указанных условиях. крови здорового человека. В реэульПосле этого в пробирки вносят сы- тате проведенного исследования полуворотку свиньи, содержащую антитела к чили следующие данные: индекс абсорбиммуноглобулинам кролика, меченую ции в опыте составил 0,99, в контпероксидазой, в разведении 1:1000. роле — 0,44. Данные позволяют гово ..

Данное разведение сыворотки обеспечн- 10 рить о наличии антител к миокарду в вает избыточное содержание антител, сыворотке крови иммунизированного меченных пероксидаэой, что необходи-, кРолика, тогда как в сывоРотке конт" мо для следующего этапа способа. Рольного животного антител к миокарПосле инкубации и отмывки в ука- ДУ не Bb»BHJIH занных условиях в цробирки вносят 15 П Р и м е Р 2. ИсслеДовали сыВосубстратную систему, состоящую из ротку больного через 20 дней после

АВ я H и 0 (АВтя - 2,2-as oó -3- операции на сердце (комиссуротомии) ,этилбентиаэолинсульфоновой кислоты)., по поводу порока сердца (митралъного

Проводят инкубацию при комнатной тем- стеноза) . В постоперационном периоде пературе в течение 25-20 мин, В те- 20 У больного развился постперикардиочение этого времени цветная реакция томический синдром, в патогенезе кодостигает достаточной для измерения торого антитела к миокарду играют интенсивности. После этого в пробир-,ведущую роль. В результате.исследоваки добавляют раствор азида натрия ния при помощи иммуноферментного спо" для блокирования цветной реаяции,Сте" 25 соба полУчены Данные: инДекс абсорб-. пень окраски оценивали при спектрофо- Ции в опыте (сыворотка больного) тометрии при длине волны 6 0 нм. . 0,89, а в контроле - 0 54. РезультаВолновые параметры подобраны для Нс- Tb1 исследования указывают на наличие пользования этой ферментной системы, антител к миокарду в сыворотке болв-.

Степень окраски в каждой пробирке из 30 но»- На основании клинических симпопытной серии и соответствующей нро- томов заболевания, а также данных, бирке из контрольной серии характе- полученных при помощи иммунофермент риэовали индексом абсорбции, который Horo способа, больному был поставлен вычисляли по формуле диагноз постперикардиотомического

ОП - ОП„ З5 синдрома аутонммунной природы и проОП веден курс иммуностатической терао .пии с положительным клинико-лабора. где ИА - индекс абсорбции; торным эффектом

ОПо показатель оптической плот- . Эффективность предлагаемого спосо нОсти В ОпытнОи серии пРо 40 ба Определения антител K миокарду бирок; в сыворотке крови больных состоит в

ОП„- показатель оптической плот- том, что Он обладает специфичностью, ности к контРольной серии для исследования достаточно наличия сыворотки больного, что исключает

Обследовали 108 доноров. Антитела 4 проведение биопсии миокарда и упроща5 к миокарду диагностируют при значениях индекса абсорбции больше 0,75.

Антитела к миокарду не выявляют при ф о р м у л а н з о б р е т е н и я значениях индекса абсорбции меньше

0,37. Результаты считали недостовер50 Способ определения антител к миоными, если индекс абсорбции находил- карду, включающий выделение карди ся в интервале 0,37"0,75. ального антигена и добавление его к исследуемой сыворотке с последующим

Пример .1. Кролика иммуни- определением антител в иммунологичес" зируют очищенным антигеном миокарда, 55ких реакциях, о т л и ч à lo al и й— выделенным в указанных условиях, пос- с я тем, что, с целью упрощения спо ле чего у него забирают сыворотку со ба, кардиальный антиген выделяют крови. Полученную от кролика сыворот- из эмбриональной сердечной ткани чеку исследовали при помощи иммунофер- ловека с помощью гель-хроматографии, 1411672 муноферментным методом IIQ, HíòåêñèBíocти развивающейся цветной реакции. а определение противокардиальных антител осуществляют твердофазным имСоставитель B,Ëèòîâ÷åíêî

Техред Л.Олийнык Корректор А.Обручар

Редактор А.Ворович

Заказ. 3649/41 Тир а47 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4