Штамм микромицета раесilомyсеs vаriотii, используемый для очистки сточных вод от фенолов или лигнина

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма гриба PAECILOMYCES VARIATII, который способен осуществлять быструю и эффективную биологическую очистку сточных вод от фенолов лигнина и его производных на предприятиях целлюлозно-бумажной промышленности. Целью изобретения является сокращение продолжительности очистки и повышение ее эффективности. Штамм выделен из гидролизного лигнина, взятого из отвалов Бобруйского гидролизно-дрожжевого завода, путем получения накопительной культуры, последующего рассева ее на чашки с агаризованной минеральной средой с фенолами (300 мг/л) и отбора наиболее активного варианта. Штамм разлагает гваякол, фенол, ванилин, бензойную, м-метоксибензойную кислоты в концентрации 150 мг/л за 12 - 20 ч культивирования на качалке при 30°С. Активное расщепление лигнинов культурой P. VARIOTII начинается с 24 ч роста и за 3 сут концентрация диоксан-лигнина в среде снижается на 30%, а лигнина Класона на 30%. 3 табл. 1 ил.

л.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК т с (Sf)S С 12 1 1 1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР (21) 4739859/13 (22) 07.08.89 (46) 23.08.91. Бюл. Р 31 (71) Институт микробиологии AM БССР (72) Э.И.Коломиец, Т .В.Романовская, Н.А.Здор, ff.А.Элланская, Б.И.Вадецкий, Г.M.Çàéöåâ, И.В.Стахеев и И.А.Босякова (53) 676.088(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ì 1130540, кл. С 02 F 3/32, 1984.

Авторское свидетельство СССР

11 1071637, кл. С 02 F 3/34, 1984. (54) НТАИМ ИИКРОИИЦЕТА PAECII.OMYCES

1 VARI0TI I, ИСПОЛЬЗУЕ1ЬЙ ЛЛЯ ОЧИСТКИ

СТОЧНЫХ ВОД ОТ ФЕНОЛОВ ИЛИ ЛИГНИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма гриба Paecilomyces variotii, который способен осуществлять быструю и эффективную биологическую очистку сточных вод от фенолов лигнина и его произИзобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма микромицета Paecilomyces variotii, который может быть использован для очистки сточных вод от фенольных соединений, лигнина и его производных на предприятиях целлюпозно-бумажной, нефтяной, углехпмической промышленности и других ее областей.

Целью изобретения является сокращение прг попя итеп ьности очистки и повышениее ее зффе ктп в ности .

Из брет ен

„„80„„1671683 А 1

2 водных на предприятиях целлюлозно-бумажной промышленности. Целью изобретения является сокращение продолжи— тельности очистки и повышение ее эффективности. Штамм выделен иэ гидролизного лигннна, взятого из отвалов

Бобруйского гидролизно-дрожжевого завода, путем получения накопительной культуры, последующего рассева ее на чашки с агаризованной минеральной средой с фенолами (300 мг/л) и отбора наиболее активного варианта. Штамм разлагает гваякол, фенрл, ванилин, бензойную, м-метоксибензойную кислоты в концентрации 150 мг/л за 12 — 20 ч о культивирования на качалке при 30 С.

Активное расщепление лигнинов культурой P.variotii начинается с 24 ч роста и за 3 сут концентрация диоксанлнгннна е среде сннааетса на 30р, а пигнина Класона — на 307.. 3 табл.

tii RK. fF-31910, который осуществляет быструю и эффективную биологическую очистку от фенолов или лигноподобных соединений .

Штамм гриба Р variotii Kp3 (gf" fF30910) выделен из гидролизного лигнина (ГЛ), взятого из отвалов Бобруйского гидролизно-дрожжевого завода.

Штамм получают следующим образом.

2 г ГЛ после продолжительного хранения вносят в колбу объемом 250 мл с >О мл среды Чапека, содержащей в качестве источника углерода смесь (100 мг /л) с1енольных соединений, наиболее часто присутствующих н промыш16 71633 ленных стоках целлюлозно-бумажных заводов — гваякол, пирокатехин, фенол, ванилин, бензойная и м — метоксибензойная кислоты, и выдерживают при 28

3 3 С в стационарных условиях. После, Ъ

20 сут инкубации 5 мл накопительной культуры вносят в колбу со свежей средой того же состава и выращивают на качалке при том же температурном режиме. Контролируют степень утилизации фенолов. После полного усвоения источников углерода из колбы делают высев в пять колб со свежей средой, содержащей 2-кратную концентрацию фе- 15 иолов (200 мг/л). С целью получения наиболее активного штамма, утилизирующего фенольные соединения, прово— дят обогащение накопительной культуры микроорганизмами-деструкторами этих 2р соединенийг Для этого из колбы, в которой процесс утилизации субстрата идет наиболее быстро, делают высев в пять колб, содержащих минеральную среду с фенолами. Из этих колб опять 25 отбирают одну, в которой процесс утилизации источников углерода происходит быстрее. Эту операцию повторяют в два раза.

Чистую культуру гриба выделяют из 3р отдельной колонии, полученной путем рассева обогащенной накопительной культуры на чашки с агаризованной минеральной средой с фенолами. Чистую культуру гриба еженедельно пересевают 35 в течение 3 мес на жидкой минеральной среде, содержащей 250 мг/л смеси фенолов — гваякола, пирокатехина, AeHoJIa, ванилина, бензойной и м-метоксибензойной кислот. Окончательно штамм полу- 40 чен путем выделения наиболее быстро растущей колонии на минеральной агаризованной среде с 300 мг/л смеси фенолов. Наряду с фенолами штамм способен к деструкции гидролизного лигнина — 45 субстрата, из которого он вьделен.

Штамм сокр lslsieT жизнеспособность в течение 6 мес при хранении на скошенном сусло-агаре и в течение 2 лет в лиофильно высушенном состоянии. 5р

Штамм гриба P.variotii КРЗ имеет следующие культурально — морфологические и физиолого-биохимические характеристики.

11орфолого-культуральные свойства, 55

Сусло-агар. Колонии округлые, поверхность мучнистая, край колонии ворсинчатый. Желтовато-коричневые со светлой каймой по краям. Н» пятые сутки роста диаметр колонии 3 см, с обратной стороны светло -коричневый пигмент. Вегетативные гифы светлые, чаще с толстыми стенками, гладкие, 3-5,5 мкм шириной. Краевые гифы утолщенные до 20 мкм. Конидиеносцы состоят из густых мет«л, несущих 27 фиалид, различных о величине, чаще 12 — 20х2,5 — 5, .3 мкм. Конидии светлые до желтых или желто †коричневых, в массе гладкие, различные по величине и hopMe, чаше почти шаровидные или эллипсоидные, иногда цилиндрические или булавовидные 3,5 — 15х х2 — 5 мкм.

Картофеле-глюкозный агар ° Колонии округлые, поверхность мучнистая, край колонии ворсинчатый. Орехового цвета, с возрастом темнеют, но никогда не бывают зелеными. Широко разрастаются на субстрате, большей частью со спороносными ползучими гифами. С обрат— ной стороны — светло-коричневые. Конидиеносные гифы с перегородками, обычно короткие, ползучие. Стеригмы 15

20х3 мкм, с длинной заостренной шейкой, часто в пучках, которые нередко расположены на веточках в кисточках, или стеригмы одиночные, отходящие непосредственно от гиф. Конидии желтоватые или коричневые, эллиптические или веретеновидные 5 — 7X2,5 — 3,0 мкм.

Агар Чапека-Докса с гидролизным лигнином. Колонии округлые, серо-коричневого цвета, состоят из тонкого войлока и множества конидиеносцев, мучнистые. Обратная сторона колонии темная. На 5-е сутки роста колонии достигают в размере 4 см. Фиалиды одиночные и в мутовках, обычно у основания расширенные, расположены на верхушках, обычно у основания расширенные, расположены на верхушках простых или разветвленных конидиеносцев, вдоль основной оси конидиеносцев или прямо на гифах, конидии в длинных цепочках.

Физиолого-биохимические свойства.

Отношение к углеводам: сахара не сбраживает; ассимилирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, ксилозу, галакто3у, арабинозу, рамнозу, лактозу, маннозу. Расщепляет крахмал, целлюлозу.

Отношение к спиртам: усваивает глицерин, дульцит, маннит, сорбит, этанол, метанол, »)» >»,1Ul, !ill< >:, »;>»<--,«>q f> » v< ;3.3fff.»очнуп>, .Ill!»<»ну», янтлрную .»у рле»ьиную, <{> ".млро»3ую я бл;>ч»» ую

Ula»3åëåf3vf<3 кислоты

Отношение к источниклм лзотл: »»спользует лммонийный азот, нитрат»»ь». », азот лсплрагинл, пептонл, мочевины.

Культура усваивает широкий спектр ароматических соединений, хорошо растет нл лигнине

Отношение к температуре. Оптимум о роста при 2-5 — 35 С, выдерживает температуру 50 С.

Отношение к кислороду: аэроб.

Растет в широких диапазонах рН

3,3 — 7,5, с оптимумом 4,5 — 5,5.

Пример 1. {<{тамм гриба P.vario выращивают на разбавленном до 1 .30

2 Б пивном сусле в течение 1 — 2 сут.

В 100 мл среды, содержащей пирокатехин или любое другое фенольное соединение: гваякол, фенол, ванилин, бен зойную, м-метоксибензойную кислоты в концентрации 150 мг/л, вносят ино— кулят в количестве 57 от объема среды и через 12 — 20 ч культивирования в

1l колбах на качалке при 30 С определяютостаточное содержание фенолов газохроматографическим методом. Полная утилизация пирокатехина,гваякола,фенола, ванилина достигается к 12 ч,а бензойной и м-метоксибензойной кислот — к 16

20 ч роста культуры (табл . 1).

Пример 2. Оценивают способность P variotii разлагать различные виды лигнинов, в частности диоксан— лигнин, по составу и строению близкий к нативному, и лигнин Класона — наиболее конденсированный и устойчивый к микробному воздействию. Диоксан-лигнин выделен из еловой древесины. le струкция лигнина Класона изучена при выращивании культуры на гидролизном лигнине, в котором содержание лигнина Класона достигает 55 — 707.. Из остальных компонентов ГЛ наибольший удельный вес занимает целлюлоза (27

307), экстрактивные (67) и минеральные (5Х)< вещества. Культивирование

P.variotii проводят в ферментере AK—

1О при 30 С, интенсивности аэрации о

1 л/л -мин и скорости перемешивания

300 об/мин на питательных средах состава, г/л: диоксан-лигнин 10 (по сухой массе).

1683

{<{{{ {О !) 5 ° I;I { I (l I О ° » -;<1» {

< куvуpу 3!lый экст»Зле" > f30:(;1 »<> I (средл 1); гидро>1»»л»»»т» XII! f вин I (l:0 сухой массе), остлньш.f< K0Mf»0»lp>!ты, 5 как в среде 1, при рН сред 5,0

В табл. 7 представлена ;и»намик. роста и потребления основных к<".»»»0— нентов средь» при н »palm»»3»3>»f»»» гр»»бл

IQ нл диоксан — лигнине и г»»дрол»»знои . »г— нине. Активное pacf плеш»е лигш»но»3 культурой P.variot ii КРЗ»»л<»»»»»лет<.»» с 24 ч роста и за 3 сут <Ьер»»е»»тл»»»» >иного процесса концентрация д»»окс»3н15 лигнина в среде снижается на 35Л, л лигнина Кллсона — íà 307. Э< .><пект»п3— ность деструкции диоксан-л»»гнина практически в раза вьппе, чеM лиг»п»на

Класона (табл. 3) .

П р е р 3. Птамм гриба Р.va

riotii КРЗ культивируют на сульфитном щелоке — основном источ»п»ке загрязне— ния сточных вод целлюлозно-бумажной промьппленности токсическими ароматическими соединениями.

Сульфитный щелок получен на Светлогорском целлюлозно-бумажном зл»»оде и имеет следующий состав, >;: cvxne вещество 17,9; зола 1,2; органические

30 кислоты 0,6; сахара 4,0; лигносульфонат 10,5. Газохроматографический анализ свидетельствует также о наличии в щелоке 16 свободных фенольных соеди— нений, среди которых наиболь»»п3й удельный вес занимают пирокатехин (238,4 мг/л), вератровая кислота (77,2 мг/л), резорцин (53,2 мг/л), м-метоксибензойная кислота (41,2 мг/л), гваякол (32,6 мг/л), ванилин

4р (30,8 мг/л), бензойная кислота (22,4 мг/л) .

При приготовлении питательной среды для P.variotii KP3 сульфитный щелок разбавляют водой в соотношении

45 1:3 и добавляют минеральные соли, г/л: ({<{{{, ) 804 0,5; КН Р04 1,0;

IlgSO< 0 5; а рН среды доводят до 5,5.

Культивирование проводят по примеру 2.

Наряду с активным потреблением саха5(ров за 12 — 16 ч роста культура полностью утилизирует абсолютное большинство фенольных соединений, щелока и только м-метоксибензойная кислота и резорцин потребляются к этому времени соответственно на 86,4 и 82,77.. При этом концентрация жизнеспособных клеток в 1 мл питательной среды увеличи вается в 4 раза по сравнению с исход ной и составляет 4 ° 10 . Это свидеT

1671683

Ф о р м у л а и з о б р < т е н и я тельствует о том, что токсические компоненты сульфитиого щелока в указанной концентрации не оказывают ингибирующего воздействия на Р.чагlOtii

КРЗ и выступают в качестве источников дополнительного углеролного питания.

1 1тамм микромицета Раес11отпусея

variotii ВКРУГ-3091Р, используемый

IUIH очистки сточных вод от фенолов или лигнина.

Таблица 1

Фенольное соединение

Показатели

ПирокЛтехин Гваякол Фенол Ванилин Бензойм-Метоксибензойная ная кислота кислота

Исходная концентрация фенольного соединения, мг/л

Длительность выра150,0

150,0 150,0 150,0 150,0

150,0

16,0

20,0

12,0

12,0

12,0

12,0 щивания, ч

Степень утипиза" ции, 7

Эффективность деструкции, мг/л ч

100,0 100,0 100,0

98,2

99,2

100,0

7,4

9,3

12,5

12,5

12,5

12,5

Таблица2

Среда I

Среда II! Длительность кул ьтивирования, ч

Концент- Выход лиг-

Рация нобиолигнина массы, г/л

Елассона, г/л

Титр кле6

Концентрация лигнина, г/л

Титр кле6 ток, х 10

Выход биомассы, г/л

10,0

5,9

9,7

5,6

8,9

5,3

4,9

7,7

6,5

4- 0

Исходная питательная среда

4

12

16

24

32

48

56

64

J,5

1,2

291

3,4

4,1

4,5

5,3

5,5

5,8

6,2

6,0

5,9

5,6

17

23

34

48

52

67

63

10,5

10,8

11,0

11,5

12,0

12,3

11,8

11,7

11,3

11,0

10,8

10,2

9,5

27

32

44

48

74

46

10

1671683

Т а блица 3

Потери лигнина, г/л

Субстрат

31,0

3,5

30,0

1,9

Составитель И. Болотина

Редактор И.Лербак Техред М,Дидык Корректор С.Шекмар

Заказ 2803 Тираж 365 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Диоксанлигнин

Лигнин

Классона

Длительность кул ьтивирования, Эффективность деструкции, г/л ° ÷

0,049

0,026

Прирост клеток, количег ство. 1О сут