Способ определения ванилилминдальной кислоты в моче

 

Изобретение относится к медицине , а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения ванилилминдальной кислоты в моче. Целью изобретения является повышение точности и информативности способа за счет учета диуреза. Способ включает предварительную экстракцию из определенного объема мочи эфиром уксусной кислоты, предпочтительно этилацетатом, проведение микроэлектрофореза проб и стандартов на ацетатцеллюлоэной пленке в пиридинапе - татном буфере, обработку пленки красителем и оценку результатов путем поперечной денситометрии при длине волны 550 нм. Коэффициент вариации по стандартным пробам составил 8,6%. Способ может быть применен для уточнения диагноза феохромоцитомы. 1 табл. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1684675 А 1 (gg)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

К А BTOPCHOMV СВИ4ЕТЕЛЬС ГВУ

2 и может быть использовано для oïðå= деления ванилилминдальной кислоты в моче. Целью изобретения является повышение точности и информативности способа эа счет учета дпуреза, Способ включает предварительную экстракцию из определенного объема мочи эфиром уксусной кислоты, предпочтительно этилацетатом, проведение микроэлектрофореэа проб и стандартов на ацетатцеллюлоэной пленке в пиридинапетатном буфере, обработку пленки красителем и оценку результатов путем поперечной денситометрии при длине волны 550 нм. Коэффициент вариации по стандартным пробам составил S 6Ж. р

Способ может быть применен для уточнения Лиагноаа феоноомоаитомы. 1 табл. Щ

1 (21) 4711380/14 (22) 29.06.89 (46) 15.10.91.Вюл. Р 38 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) О.И.Свистунова, В.А.Амелюшкина и В.Н.Титов (53) 612.015 (088,8) (56) Vanililmandelic acid "from", urine — Sales Technical and

0rdei Information and Service

Assistance "Helena Laboratories", 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВАНИЛИЛМИНДАЛЬНОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, Изобретение относится к медицине, точнее к клинической биохимии, и может быть использовано при диагносI ,тике симптоматической гипертонии и скрининге феохромоцитомы в лабораториях биохимии, специализированныхучреждениях и клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений.

Цель изобретения — повышение точности и информативности способа за ,счет учета величины диуреэа — достигается тем, что ВМК предварительно экстрагируют из суточного объема мочи эфиром уксусной кислоты, предпочтительно этилацетатом. После проведения микроэлектрофореза проб н стандартов на ацетатцеллюлоэной пленке в пиридинацетатном буфере и обработки пленок красителем оценивают результаты путем поперечной денситометрии при длине волны 550-550 нм.

Способ осуществляют следующим образом. 1Ь

Для работы берут 1-1,5 мл суточ- 3 .ной мочи (pH доводят до 1,0 5н. НС1), Ю добавляют 1-1,5 мл насыщенного раствора Na01 и 4-6 мл этилацетата. Пробу встряхивают в течение 1 мин, дают отстояться в течение 20 мин, оргенический слой отсасывают в другую про- Ь бирку, экстракцию этилацетатом проводят дважды. Органический слой объединяют и выпаривают в вакуумном су иильном шкафу. Экстракт растворнют в 5075 мкл дистиллированной воды. Пробы в

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1684675 объеме 0,5 мкм наносят аппликатором на заранее смоченную в пиридинацетатном буфере (пиридин/уксусная кислота/

/вода 3,5/16/980,5 (V/V) ацетатцеллюлозную пленку (катодная аппликация), Одновременно с пробами на пленку наносят и стандартный раствор ВМК в концентрации 100 мкг/мл. Электрофорез проводят в пиридинацетатном буфере указа. .íîãî вьш.е состава при постоянном напряженпи 200-220 В в течение

18-25 мин при комнатной гемпературе.

По окончании электрофореза пленку сушат в струе теплого воздуха (фен), 15 опрыскивают раствором диазотированного п-нитроанилина, сушат в струе теплого воздуха и сканируют на д"иситомечре (фирма eel((Aao). Для при"отовления красителя берут: а) 0,1%ьн-гй раствор и-нитроапилина (0,5 г и-нптроа растворяют в 10 мп концентрированной НСТ, объем лово".т до 0,5 . t полей), б) 0,27-ный раствор NANO> ., в) 107.-ный раствор .СО,,непосрелсгвенно перед упот:" 1er-. roговят смесь: 1 объем (a)+

"съем (б), через 4-5 мпн — 2 объ:а в) сме; ь голна 1-2 мин. ч ракция ВИК при проведении электро,, ;реза в данных условиях, как и в мели1е фирмы "Helena", движется к анои образует при окрашивании темнофиолетовую полосу, перпендикулярную ап," вле11ню злектрофореза на расстоянии 3 см от линии старта ° Однако за счег редварительной экспертизы число ополнительных фракций в электрофорег-рамме каждого образца уменьшается.

При использовании ацетатцеллюлоэ40 ных пленок фирмы Вес1сшап коэффициент вариации составляет 8,67, потери стандарта после проведения электрофореза 2 i,27., после экстракции и последующего растворения в воде—

29,07.

"15

При денситометрии максимальная оптическая п.IQTHocòü фракций Вг1К была получена с использованием светофильтра с длиной волны 550 HM. Ли 0 нейность сохраняется в пределах 20:-00 мкг/мл.

Аналогичные данные были получены при использовании отечественного аппарата для электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках ЭПАУ вЂ” 20-50 н о гечественных ацетатцеллюлозных

1и. енках,фирма Таама., Казань). Коэф- t ч1 ; г нар;1а; nи д . l э ги, x словий сос. талляет 9,27., линейность 30

300 мкг/мл, потери стандарта после электрофореза 27,27,. Для проведения скзнпрования можно использова.ь интегрирующий денситометр из комплекта аппаратуры Биан (Красногвардеец, Ленинград).

Расчет количества ВИК проводят по формуле

А х 100

l (мг/сутки) — — — — х

8х20х0,71 х диурез, где А — относительная площадь (7) пи ка пробы на денситограмме;

 — относительная площадь (7) пика стандарта на денситограмме; 0,71 — потери при проведении экстракции;

20 — коэффициент концентрирования; пиурез — в литрах. Содержание Вг1К в моче в норме до

7.,5 м1/сут.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Ацетагцеллюлоэную пленку 90 х 90 мм (фирма Тасма, Казань) замачивают в пиридинацетатном буфере. Готовят стандартные растворы

В!!К в воде концентрацией 30;40;50;

7 ° и 100 мкг/мл. Стандартные растворы и-выносят аппликатором на подсушенную на на фильтровальной бумаге пленку.

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 В, при комнатной температуре в течение 20 мин в пири1 динацетатном буфере. По окончании

;электрофореза пленку высушивают в струе теплого воздуха и окрашивают свежепри" готовленíbM раствором диазотированного n-нитроанилина. Электрофореграмму сканируют на денситометре Вес1 тап.

Коэффициент вариации метода по стандар1нь.м растворам составил 8,67, II р и м е р 2. Больная О., 30 лет (ИБ - 1193--3925). Диагноз — симптомами. тическая гипертония (феохромоцитома?).

1"злобы: головная боль, боли в области сердца, головокружение, учащен:.ые ночные мочеиспускагия (2--3 раза/ночь), потливость, подъем АД до

260/170 мм рт,ст. В промежутках между крпз 1ьв1 АД 130/80 мм рт ° ст, лри аорто-5 16846 графин обнаружена гиперваскулярная опухоль левого надпочечника (феохромоцитома?). При NP-томографии: в проекции лев.зго надпочечника и несколь5 ко ниже определяется дополнительное образование округлой формы, неоднородное по структуре, 3,7 х 2,5 х х 4,1 см (феохромоцитома?).

При проведении анализа на БМК 10 (диуреэ 1250 мл) к 1 мп мочи (рН доводят до 1,05 н. НС1) добаьляют 1 мл насыщенного раствора ГаС1 и 4 мл этилацетата. Пробу встряхивают в течение минуты, дают отстояться в течение 20 мин, сргани ескнй слой отсасывают в другую пробирк„, экстракцию этилацетатом проводят дважды, Органичес.кий c«ýI! объединяют и вы— паривают в вакуумном сушильном шкафу.. 20

А.

Экстракт растворяют ч 50 мк.; дистиллированной воды. Р4. Пробы в объеме

0,5 мкл наносят аппликатором на заранее смоченную в пирндннацетатном буфере (пиридин/уксусная кисло- 25 та/вода 3,5/16/980,6 V/V) ацетатцеллюлозную пленку (катодная GJIBJIHKB ция), Одновременно с пробами на пленку наносят и стандартный раствор

ВМК в концентрации 100 мкг/мл. Элект- 30 рофорез проводят в пиридинацетатном буфере указанного выше состава при постоянном напряжении 220 В в течение 20 мин при комнатной температуре.

По окончании электрофореза пленку сушат в струе теплого воздуха (фен), опрыскивают раствором д .азотированного п-нитроанилина, сушат в струе теплого воздуха и сканируют на денситометре. Для приготовления красителя 40 берут: а) 0,1%-ный раствор и-нитроанилина (0,5 г и-нитроанилина растворяют в 10 мл конц.НС1, объем доводят до 0 5 л дистиллированной водой);

6) О, 2Х-ный раствор NaNO<, В ) 10%-ный 45 раствор К СО, непосредственно перед употреблением готовят смесь: 1 объем (а) + 1 объем (б), через 4-5 мин

2 объема (в), смесь годна в течение

1-2 мин. Сканирование проводят при длине волны 550 нм в направлении, поперечном движению фракций через пробы и стандарты одновременно.

При проведении первого анализа фракция ВМК от соседних фракций не огделилась, из-за повьппенного содержания ВМК в пробе, При повторном анализе мочу развели в 2 раза дистиллиЭкскреция ВИК с мочой в разных группах пациентов

ВМК мкг/мл

Г п сло паентов

Новый Прототип метод

2,0-5,0 Т2,0

11,7-61,2 20,0

0,8-3,2 6 0

10

Формулаиэобретения

Способ определения ванилилминдальной кислоты в моче, включающий микроэлектрофореэ проб и стандартов на ацетатцеллюлоэньм пленках в пиридикацетатном буфере при комнатной температуре и постоянном напряжении с последующей обработкой пленки красителем и оценкой результатов, о т л и ч а ю75

6 ровааной всрой, Содержание ВМК в мо— че — 24,6 мг/сут (феохромоцитома? ) .

После операции — левосторон яя адреналэктомия по поводу феохромоцитомы левого надпочечника (операция по витальным показаниям). Содержание

ВМК в моче (диуреэ 980 мл) составило

5.6 мг/сут.

Пример 3. С помощью предлагаемого способа были обследованы следующие группы паииентов:

A — больные с артериальной гипертонией;

Б — больные с симптомагиче..кой ги;ертонией (феохромоцитома);

 — практически здоровые лица.

Результаты представлены в таблицг.

При рассмотрении полученных данных н»обходимо учитывать, что по прототипу норма составляет 1-7 мг л BtiK без учета диуреза, по нашему методу — до

7,5 мг/сут с учетом диуреза. iàêèì образом, из всего представленного материала следует, что предложенный способ позволяет количественно оценивать содержание ВМК в моче, тогда как по способу-и;.ототипу возможна только качественная оценка экскреции RNK. Это дает воэможность проводить уточнение диагноза сиптоматической гипертонии (феохромоцитомы).

1684675

Составитель А.Агуреев

Техред Л,Сердюкова Корректор Ч.Ревская

Редактор А.Маковская

Заказ 3502 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 шийся тем, что, с целью повышения точности и информативности способа при исследовании диуреэа, микроэлектрофореэу подвергают экстракт ва5 нилилминдальной кислоты, получен- 1 ный из аликвоты суточного объема мочи, на ацетатцеллюлоэную пленку йаносят не менее двух стандартных растворов ванилилминдальной кислоты в возрастающей концентрации, а оценку производят путем поперечной денситометрии при длине волны 550 нм.