Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент l-треонина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4334022/13 (22) 26.11.87 (46) 30.11.91. Бюл. Иг 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) В.Г.Дебабов, Ю.И.Козлов, Е.М.Хургес, В.А.Лившиц, Н.И.Жданова, M.M.Ãócÿòèнер, А.К.Соколов, Т.А.Бачина, H.Ê.ßíêoâский, Ю.Д.Цыганков, А.Ю.Чистосердов, Т.Г.Плотникова, И.О.Шакалис, А.В.Беларева, P.À,Àðñàòÿíö, А.Ф.Шолин и Т.M.Ïîçäíÿкова (53) 663.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 974817, кл. С 12 Р 13/08, 1981.

Авторское свидетельство СССР

М 1362021, кл, С 12 P 13/08, 1987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

CGLl — ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего незаменимую аминокислоту L-треонин, который применяется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения, в качестве добавки в корма животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности.

Цель изобретения — штамм бактерий, позволяющий получить высокий выход (=

„„5U,, 1694643 At (sljs С 12 Р 13/08, С 12 N 15/00 незаменимую аминокислоту L-треонин, который применяется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения, в качестве добавки s к оoр ма животных, а также как реактив дпя фармацевтической и химической промышленности.

Цель изобретения — штамм бактерий

Escherlchla coll ВКПМ-3996, позволяющий получить высокий выход L-треонина в условиях большого числа генераций бактериальной культуры. Штамм содержит рекомбинантную ппазмиду рИ С40. которая в отличие от плазмиды pYN 7 известного штамма-продуцента стабильно сохраняется при росте культуры без сепективного давления, направленного на поддержание ппаз-миды. Предлагаемый штамм позволяет получать до 85 г/л L-треонина за 36 ч ферментации в лабораторных условиях. В условиях, аналогичных -промышленной ферментации по числу генераций, продуцирует до 79 г/л L-треонина эа 50 ч ферментации. 3 табл. треонина в условиях большого чи па генераций бактериальной культуры при отсутствии в питательной среде антибиотика.

Новый штамм бактерий Escherlchia соИ ВНИИгенетика-640 содержит рекомбинантную ппазмиду pVIC 40, которая в отличие от плазмиды рУМ7 известного штамма-продуцента L-треонина Е;coll

ВКПМ В-3420 (лабораторный номер ВНИИгенетика ТДГ-6) стабильно сохраняется при росте культуры без селективного давления, направленного на поддержание ппазмиды, 1694643

25

30 условиях, Новая гибридная плазмида pVIC 40 получена путем обработки плазмиды pYN 7, а 35

45

50 но не к пенициллину, и несущая фрагмент плазмиды рУИ7, детерминирующий ген треонинового биосинтеза у Е.соИ. 55 т.е. в отсутствие в питательной среде антибиотика. Это свойство плазмиды pVlC 40 позволяет предлагаемому штамму обеспечивать высокий вывод треонина в условиях большого числа генераций .бактериальной культуры, а именно при обогащении питательной среды ростовыми факторами (аминокислотами), а также в условиях промышленного производства.

Предлагаемый штамм позволяет получать до 85 г/л треонина за 36 ч ферментации в лабораторных условиях. В условиях, аналогичных промышленной ферментации по числу генераций (клеточных делений) культуры на средах без антибиотиков, штамм продуцирует до 79 г/л 1=треонина эа

50 ч ферментации. Накопление подобных аминокислот (аланин, глицин, глутаминовая кислота) составляет не более 3 г/л, Новый продуцент получен в результате генетической трансформации плазмидой

pVlC 40 бесплазмидных клеток известного штамма ВНИИгенетика ТДГ-6 и сохраняет те генетические свойства известного штамма, которые определяются хромосомой клеток. Новая гибридная плазмида рЧ!С40 несет тот же фрагмент хромосомы Е,coll, что и плазмида pYN7, кодирующая ген биосинтеза треонина, и сообщает клеткам устойчивость к антибиотику стрептомицину.

В отличие от нее новая плазмида сохраняется в клетках при росте в неселективных также векторной плазмиды, являющейся производной известных плазмид pRSF1010 и pBR322, характеризующейся высокой стабильностью в клетках Е.соИ, рестриктазами

8am Н 1 и Pst 1 с последующей обработкой полинуклеотидлигазой. Смесью после лигирования трансформировали клетки бес-. плазмидного варианта штамма

ВНИИ-генетика ТДГ-6, нуждающегося в треонине, и на минимальном агаре (среда

Mg), лишенном треонина, но содержащем. стрептомицин (100 мкг/мл), отбирали.колонии трансформантов, утративших устойчивость к пенициллину. Из клеток одного такого трансформанта выделена плазмида рИС40 с молекулярной массой 9,7 МД,.сообщающая устойчивость к стрептомицину, Штамм депонирован во .Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В КПМ B-3996 и имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные слабо подвижные палочки с закругленными концами. размер 1,5 — 2 мкм в длину.

Мясо-пептонный агар. Через 24 4 роста при 37 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5- 3 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агар-Луриа, Через 24 ч роста при 37 С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 — 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная минимальная среда

Адамса, Через 40 — 48 ч роста при 37 С образует колонии диаметром 0,5 — 1,5 мм, серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью.

Рост в мясо-пептонном бульоне. Удельная скорость роста при 37 С 1,3 ч 1. После

24 ч роста происходит сильное равномерное помутнение, имеется характерный запах.

Физиолого-биологические признаки.

Отношение к источникам углерода: хорошо растет на сахарозе, глюкозе, фруктозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине,манните с образованием кислоты и газа.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммония, солей азотной кислоты, а также азот некоторых органических соединений.

Желатину не разжижает. Рост на молоке хороший с коагуляцией молока.

Индол не образует.

Устойчив к стрептомицину, (=треонину и L-гомосерину.

Стимулятором роста является L-изолейцин. При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует.

Факультативный анаэроб.

Растет на мясо-пептонном бульоне при 37 С и ниже. Оптимальная температура 37 — 38ОС.

Растет на жидких средах, имеющих рН от 6 до 8. Оптимальное значение рН 7,0.

Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плаэмиду pVIC

40 (молекулярная масса 9,7 МД), обеспечивающую устойчивость к стрептомицину и несущую гены треонинового оперона.

Стабильность плазмиды. Штамм Е.coll

ВКПМ В-3996 характеризуется повышенной способностью к сохранению плазмиды при росте без селективногодавления, направленного на поддержание плаэмиды.

1 6;14643

Оценку стабильности признаков штамма, определяемого плазмидой, проводили у предлагаемого (плазмида pVlC 40) и известного (плазмида pYN 7) штаммов. Клетки обоих штаммов выращивали в присутствии соответствующего антибиотика до ранней стационарной фазы и засевали среду Луриа, лишенную антибиотиков, с исходным титром 5. После 48 ч культивирования полученными клетками вновь засевали такую же среду до исходного титра 50 и вновь инкубировали 48 ч. Каждый пассаж соответствовал 20 генерациям. После указанных пассажей клетки высевали на агаре Луриа и выросшие колонии проверяли на устойчивость к стрептомицину и пенициллину (табл.1).

Иэ данных табл.1 видно, что плазмида рИС 40 стабильно сохраняется в клетках нового продуцента в неселективных условиях. В этих же условиях клетки известного штамма быстро утрачивают плазмиду.

1G

Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществляют следующим образом. Культуру штамма

Е.coll ВКПМ В-3996 выращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином и суспензией клеток, выращенных таким же

30 образом, засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Эти среды содержат источник углерода, азота, необходимые минеральные соли, а также питательную добавку в аиде гидролизатов белковых субстратов (присутствие этой добавки в ферментационной среде не обязательно).

Выращивание посевного материала ведут в условиях рН-статирования при рХ 6,8 — 7;2, температуре 36 — 38 С с непрерывным аэоированием и перемешиванием. Приготовленный таким образом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют для засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, азота, ми40

45 неральные соли, а также питательную добавку в виде гидролизатов белковых субстратов (при низких дозах засева указанная добавка позволяет сократить продолжительность ферментации, при высоких

38 С с непрерывным азрированием и перемешиванием. В качестве рН-статирующего агента применяют либо аммиачную воду, либо сбалансированную по углероду и азоту сахаро-аммиачную годпитку. Продолжительность ферментации зависит отдозы эадозах засева присутствие ее не обязатель- 50 но).

Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системой рН-статиро-, вания, при рН 6,8 — 7,2, температуре 36 — сева и степени обогащения ферментационной среды ростовыми факторами и мо>кет составлять 24 — 60 ч. К концу ферментации накапливается 70 — 85 г/л L-треонина.

Удельный расход источника углерода на синтез 1 г L-треонина составг яет 2 — 2,3 г.

Накопление аминсацетона в культуральвой жидкости отсутствует, Пример 1,Культуры штаммов ВКПЧ

В-3420 и ВКПМ В-3996 параллельно выращива.от на агаризованной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2%) и антибиотики (500 ед/мл пенициллина для известного штамма и 100 мкг/мл стрептомицина для предлагаемого штамма). Клетки, выращенные в течение 2 сут, суспендируют в физиологическом растворе и 10 мл суспензии с титром 10 используют для засева 500 мл посевной среды следующего состава, %: сахароза 4; аммоний сернокислый 0,5; калий фосфорнокислый 2-замещенный 0,2; магний сернокислый 7-водный 0,04; железо (ll) сернокислое 7-водное 0,002; марганец (ll) сернокислый 5-водный 0,002; автолизат дрожжей 0,2; вода остальное.

Посевной материал выращивают в течение 20 ч в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании (0,5 n/Mèí) и перемешивании со скоростью 1000 об/мин при 37 С. Значение рН автоматически поддерживают в пределах 6,9 «+ 0.2 аммиачной водой. Выращенным посевным материалом с титром 7 — 8 10 в количестве 50 мл засевают ферментационные среды обьемом 500 мл. Состав ферментационной среды такой же, KBK и состав посевной, но концентрация сахарозы 3% и дополнительно внесен хлористый натрий (0,06%), Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании 0,5 л/мин воздуха и перемешивании co ñêîðîñòüto 1200 об/мин и при температуре культивирования 37 С. Значение рН поддерживают в пределах 6,9+0 2 путем автоматичсской подачи сахаро-аммиачной подпитки, представляющей собой смесь 70,-ного раствора сахарозы с 25%ной аммиачной водой в соотношении 3,6:1 по обьему. Ферментаци о проводят в течение 36ч. Результать, проведенного процесса показа" û в табл,2.

Пример 2. Культуры штаммов Е, coll

ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 вырагцивают аналогично примеру 1, но полученную клеточную суспензию разводят физиологическим раствором до титра 10 и 1 мл такой

2 суспензии используют для засева 500 мл ферментационной.среды, отличающейся от указанной в примере 1 ферментационной среды повышенным до 0.5% содержанием

1694643

Таблица 1

Доля клеток известного и предлагаемого штаммов, утративших плазмиды при пассировании в среде Луриа

Таблица 2

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах беэ антибиотиков в лабораторных ферментерах автолизата дрожжей (моделируется вариант засева производственного ферментера объемом 1000 м суспензией клеток, смытых с

1 косяка). Ферментацию проводят втечение

50 ч в условиях, аналогичных указанным в 5 примере 1. Результаты проведенного процесса показаны в табл.3.

Пример 3. Культуру штамма ВКПМ

В-3996 выращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином, как показа- 10 но в примере 1, затем клетки суспендируют в физрастворе и полученной суспенэией засевают. посевную среду, аналогичную приведенной в примере 1, но отличающуюся заменой сахарозы на мелассу(4% по саха- 15 ру). Выращивание посевного материала ведут по примеру 1. Через 18 ч готовым посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую 4% мелассы (2 % по сахару ), 1,5 сернокислого аммо- 20 ния и минеральные соли, перечисленные в ферментационной среде примера 1. Для рН-статирования в ходе ферментации используют мелассно-аммиачную подпитку, представляющую собой смесь 30 -ного по 25 сахару раствора мелассы с 25 -ной аммиачной водой в соотношении 12:1 по объему.

Ферментацию проводят в течение 36 ч.

К концу ферментации в культуральной 30 жидкости накапливается треонин в концентрации 44 г/л. Доля клеток, утративших плазмиду, менее 1 .

Сравнение предлагаемого и известного штаммов в условиях небольшого числа клеточных генераций без антибиотика (пример

1) показывает одинаковую продуктивность штаммов (82 — 85 г/л).

Преимущества предлагаемого штамма проявляются в условиях большого числа клеточных генераций (пример 2), т.е. в условиях, моделирующих производственные в отсутствие антибиотика. В этом случае уровень накопления треонина предлагаемым штаммом в 1,5 раза выше, чем у известного штамма (79 г/л треонина против 53 г/л). Это объясняется тем, что значительная доля клеток известного штамма на обогащенных средах без антибиотиков утрачивает плазмиду, в то время как потери плаэмиды у предлагаемого штамма в этих условиях не отмечены.

Таким образом, предлагаемый штамм позволяет в производственных условиях увеличивать выход L-треонина и упростить процесс за счет полного исключения применения антибиотика в процессе выращивания посевного материала, Формула изобретения

Штамм бактерий Escherlchia coll ВКПМ

В-3996-продуцент L-треонина.

1694643

Таблица 3

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах без антибиотиков в условиях, моделирующих по числу генераций производственные условия

Редактор М.Петрова Техред М.Моргентал

Корректор; М.Демчик

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 4130 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5