Способ определения повреждений днк в растениях

 

Изобретение относится к радиобиологии и цитогенртике и касается определения повреждений ДНК в индивидуальных растительных клетках. Целью изобретения является упрощение способа определения повреждений ДНК в растениях. Способ заключается в том, что проростки растения выдерживают в этанол-уксусном фиксаторе, осуществляют кислотный гидролиз, а о наличии повреждений ДНК в индивидуальных клетках судят на основании результатов спектроАотометрического анализа. 4.ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К д BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4678453/13 (22) 11.04.89 (46) 30.10.91. Бюл. ¹ 40 (71) Институт биологической физики АН

СССР ($Н) и Институт биофизики (CS) (72) Е. 3. Ганасси, С.И. Заичкина (Яо) и Петр Круглик (С$) (53) 575.224.4.08(088.8) (56) Сергеева С.А. и др. Генетика, 1984, т. 20, ¹ 99,,::сc, 1480-1483.

$. Tano, Н. Jamaguchi Mutation

Research, 1977, № 42, р. 71-78 °

Изобретение относится к радиобиологии и цитогенетике, а именно к способам .определения повреждений ДНК в индивидуальных растительных клетках, .и может быть использовано для выяснения механизма действия различных агентов на хромосомный аппарат растительной клетки, в частности для измерения необходимого количества повреждений ДНК для образования хромосомных аберраций в индивидуальной клетке, а также для определения нарушений в индивидуальной клетке при культивиро.вании растительных тканей и для контроля состояния ДНК в клеточном ядре при создании новых кариотипов в генной инженерии.

Целью, изобретения является упрощение способа выявления повреждений ДНК в растительных клетках.

На фиг. 1 представлено распределение значений степени кислотной денатуI

„.Я0„„1688160 А 1 (g)g С 01 N 33/50, С 12 _#_ 15/01

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ

ДНК В РАСТЕНИЯХ (57) Изобретение относится к радиобиологии и цитогенетике и касается определения повреждений jIHK в индивидуальных растительных клетках. Целью изобретения является упрощение способа определения повреждений ДНК в растениях. Способ заключается в том, что проростки растения выдерживают в этанол-уксусном фиксаторе, осуществляют кислотный гидролиз, а о наличии повреждений ДНК в индивидуальных клетках судят на основании результатов спектрофотометрического анализа. 4 ил. рации PHK — oC в популяциях индивиду- С альных клеток от дозы лучевого воздействия; на фиг. 2 — график зависимости средней для популяпии величины ьЬ от дозы облучения, на фпг. 3 — график зависимости Ь0о(разность значений между величиной Q в облученных и необлученных клетках) от дозы облучения

1 на фиг. 4 — график зависимости степени повреждения ДНК вЂ” Д от времени ре- 4 парации повреждений . 4Р

Таким образом, разница в степени кислотной денатурации ДНК вЂ” Ag в индивидуальных растительных клетках, подвергнутых мутагенному воздействию, и контрольных (неподвергнутых мутагенно- му воздействию) действительно характе- Э. риэует степень повреждения ДНК и служит мерой повреждения ЛНК.

П р и и е р 1. Определение повреждений,НК в индивидуальных клетках

1688160

Ч с1л faÜB (>n Bitu), подвергнутых действию -облучения.

Эксперименты проводят на меристематических клетках первичного корня

Vicia faba cv,, IBov c,.

Одинаковые по Beaè÷èíå семена за— мачиван т в проточной иоде в течение

6-7 ч. Затем помещант Нх во влажный песок и содержат в термостате при о, 21 С. Первичные корешки отбирают нл

4-5 день после проращивания при стан— дартной длине 5-7 см. Облучение коl о решков проводят от источника Со при мощности дозы 0Ä726 Гр/мин в дозах 10, 15 и 20 Гр. 1- епосредственно после облучения верхушки корней обрезают и фиксируют в этанол-уксусном фикс.аторе (3:1) и течение 24 ч. В дальнейшем корешки подвергают гид1>о- 20 лизу в 1 N EIC1 при 60 С в течение

;11 мин, затем готовят длвленные через покровные стекла в 45%-ной уксусной кислоте цитологические препараты.

Покровные стекла удаляют при помощи 25 сухого льда. Высушенные цитологические препараты проводят через ряд спиртов уменьшающейся концентрации (96, 70, 50 и 30%) и цитрлтный бу*ер (РН

4,3). Затем препараты окрашивают в 30 течение 15 мин в акридин оранже (7 .10 ), приготовленном на том же

-6 цитрлтном буфере, и отмывают в цитратном буфере 3 разя TIo 5 мин.

При помощи микроспектрофлюориметра 3> исследуют люминесцг нцию однонитевых (I 6 10 H*< — красное с в ечение) и двуните(Т 520км зеленое свечение) участков ДНК и определяют отношение тб о

610 ь 0 характеризующее степень денлтурации

ДНК в контрольных и опытных образцах.

Распределение значений степени кис-45 латной денатурлции ДНК вЂ” g в популяциях индивидуальных клеток контрольного и облученных в дозе 10, 15 и

20 Гр образцов представлено на фнг,1.

Как видно из фиг. 1, значения широко варьируют в индивидуальных клетках как R контрольных (кривая 1), так и в облученных образцах (кривые

2-4). Однако в клетках, подвергнутых облучению, интервал значений ОЕ существенно отличается от интервала значений контрольных образцов н зависит от дозы облучения. Так, интервал значений М. и контрольных клетках иэ княеггя 0 13 до 0;37 а при дозе 10, 15 и 20 Гр — от О, 16 до

0,53, от 0,27 до 0,57 и от 0,35 до

С,76 соответственно.

Результаты провепенных измерений показывают, что наблюдаемые при воздействии радиации смещения интервалов значений в индивидуальных клетках, выявленные при кислотной денатурации

ДНК, характеризуют степень индуцированного облучением повреждения ДНК.

Затем опредепяют среднее значение

K для каждой дозы по результатам измерения в индивидуальных клетках, Для этого проводят измерение значений р не менее, чем в 200 клетках в 3-4 повторных опытах. Средние значения (, пля каждой группы облученных при разных дозах клеток представлены на фиг „?..

Как видно иэ фиг. 2, значение в облученных образцах растет линейно от дозы, Затем по разности для облученных и необлученных клеток определяют степень радилционного повреждения

ДНК вЂ” 1 ф„

Среднее воление О в необлученных клетках было равно О,?4 0,04, а в облученных и дозе 20 Гр клетках — 0,06+

+0,08, Отсюда 5< для дозы 20 Гр (т.е. степень радиационного повреждения

ДНК при этой дозе) равняется 0,36+0, 04.

Лнллогичным образом определяют при. дощлх 10 и 15 Гр, Среднее значение

0 для этих доэ составляет 0,35+0,05 и 0,45 -С,Об, л степень радиационного повреждения JJHJ< ЪМ) — 0,1 1+0,0 1 и 0,21+0,02 соответственно. Зависимость от ««озы облучения представленл нл фиг, 3 и имеет линейный характер.

Тлким образом, кислотная денлтурация ДНК действительно позволяет выявить разницу между неповрежденной ДНК в интактных клетках и ДНК, поврежденной облyyчaением„

П р и и е р 2. Определение репарации повреждений ДНК в летках Vicia

faba в разные сроки после облучения.

Для определения Репарации повреждений ДНК пропорщенные клк в примере

1 корешки V. faÜa облучлют в дозе

20 Гр при темперлтуре тающего льда.

Часть корешков фиксируют сразу после облучения, л другун часть помещают в воду при 20 С и фиксируют через 15, 30 и 60 мин после облучения При этом кислотную денатурлццю ДНЕ, последующее

1688 1 бр

Окр )!t!t :Olitfc !!it т>;ic —,.IT>qr / xttx npenapa

T0II t«> > РС> т)С> I/ / l!С " t à 11С : i i it Гт> ттРС>жт|Е НИЯ ,ГППС вЂ” гт<,,с сутт!с!- !-чя, г > - ; г и;-имере i „

" > авит !!мос-. ь степ!-ни пог реждения

ППК (g)C/",,i от т|рем..нti ренара)и|и повреждении, т>рс:.: !ет!г! г!Осле об |ут!е|!Ня) представлена "а .""г:

Ка i: вид!10 tie r )tfi, /т., ) (6 снижается

В заВИСИ 0>0TH С т iPG/|О|!ж1! > С!1Ь!!ОСТИ

ВGCC 1 1!1:.>т!|IС т.|f;1 О />тpл>т "ie .:1 1; :,!Ii/>

Таки!1 Обра":!);" . Внг>ст|е)тт!!>!е в приМЕрах КОНКр"". IGI С) 1/ЫПОЛ i=т!Ия рЕВуЛЬтаты спидет: .:ьс i дт о том что пред.тlагает !.-111 01IG Об - >то Витег||,НО TT03BOJIIT ет ныяв!!Ть по;:р-. . ..ния ДКК в клетках

И В C)Т .-..1/П!С-. Gò:/ > Н О С /Iti>IX ОПРЕДЕЛИТЬ

:.огре. .;,.1/ н1!Н,ПП)Е н и:.:II;J>..тдуа:|ьных расI

Т1 i C. т/.!//,IX i Л; —,!:ð TХ

ii i) и и е» 3. 0-тг)еде|!ение повн/ ж т iiii i II I:; а клетка. Сi е,)iÿ /GBp17.1!ат.| я„

Семс на Гсср ;: c.. l p:.1 at iв по!!е)!|ак)т на 1«T;i; ные )!frit.тр/: в та!пки Петри и о держат в термостате. при 25 0 до прор;|стан||я. тГер |и !Ные копст|кц Отбт!рак)т

ЧЕ!)СЗ 3 t |т0/ . !О ii/lч//. !а 1!Рот)аЩИБаНИЯ

Облу -.а!от т позе 20 Гр От источника

60СО г|р!; помои|и —.,I)at>1 0-7; 6 Гр//.!Ин, > НОг )" ттс ттЗ ОН ilA .Ii)> т Р об т! >/ченHII G t ре

О-.анод-,ксусном растворе (3 1,т. Кислотн."!Ст донатуpRIIITIc Пт)К, г!Ослс,!>, tt)t>zoic

От -,, -; т >ti iаН!|Е )тт / ОЛ() ГИЧС С !Ст!Х !) > П!1 ра Оii с д|)едегение степен)-: пенат p >ttHtf V, Zi 0т/|ЕЛЬН>IX КЛС. ТКа>Х П| 01)ОДЛТ

С»-.;; —,.Е, КаК О|тИСЯНО Н т/РИМЕРЕ 1. (-РС1(-1"-/!ение ч н"обл.чeft :» ; t ."с-тках

|..- i>0 0,321+0„0ч, а в GI).fученны.-: в доГр — 0,бб+О 07: 0тск)да г./ для

/О

Р Гр /,ò>е, стс:г!ень рад.:апионно—.-О 11;p0)I; tet-tH<1 Ц|К !!ри ".-Оц /-„. зе)

-.„-;=-:,.няс .-.-я О, 32+Ci,05, !т;- хор! m0 соче—. c l c/ с данными, !/Олуче!1!!юш на прор .: гк; ". i с1а faba,и д;:. -;Онстрирует —;.:;".:-=p. ально;ь прс zòtzагаемого метода

0» t/C :1/ОНИ|1 pß:T Jtt> «НЫХ p i!- T) IT 0! IZ>ftbTZ

20 - с р и у л а и з с б р е т е н и я

0 —;C C Об ОПрсдЕЛЕНИя ПОВ1)ЕжцЕНИй IÈi в г,".c ò". -- и !Ях, 0 т л и "i .0 K) щ и й -ем, !-то, с пе :ь|в угр:-:.ZeI ия

25 .-...;: г Оба ..трстрос тки растений выдержи- <-, > /,. )t 0t! > к с / сном ст)ик атс)рт/>, а!Е» /- IIX !С!!СЛС-, 1 Но!Bi; 1 1/ДРОЛИВУ

1;,".ли-тии дувре)к/Zе))ий |!1!К TT ипдиВи„- : = -тьд! к;,тетках судят на основании.э,/т -;::;;. -.-т.-, ";:З СПЕ|,т )0/рс>ТС)!т;-/р!ГЧЕСКОГО

1 .ЯК!6()

"/,»

Ф . (/

ФЬг 1 д

0й

Ц,й

0,2

К

qc, Iu

) ji фцу

0 0

Пе6

0,2

60 иин.

Фиг,4

Составитель С. Бандрин

Техред М.Дидык

Корректор Н.Ренская

Редактор А. Лежнина

Заказ 3705 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101