Способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили

 

Изобретение относится к биоте хнике и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили. Цель изобретения - повышеИзобретение относится к биотехнологии и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона (ИИФ) при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили Цель изобретения - повышение выхода и патогенности инфекционного канала. Способ осу и (ествля ют следующим образом . ние выхода и патогенности инфекционного начала. Способ заключается в следующем: готовят питательную среду следующего состава , мас.%: дрожжевой экстракт 0,05-0,1; картофель 15,0-20,0; капуста 10,0-20,0; глицерин 1,0-3,0; калий щавелевокислый 0,05- 0,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,2; магний сернокислый 0,03-0,07; вода остальное. Питательную среду засевают культурной гриба Tbacicola - возбудителя черной корневой гнили хлопчатника - и культивируют при 26°С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и смешивают с двуокисью кремния и каолином в соотношении 1:3-1:4, причем двуокись кремния и каолин берут в соотношении 2:1. Полученным препаратом обрабатывают семена хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили. Предлагаемый способ позволяет увеличить титр гриба с 48,7 до 190 млн/мл и обеспечить пораженность взрослых растений с 10,9 до 41,7%, а всходов с 47,4 до 60,8%. 6 табл. (А С Готовят питательную среду следующего состава, мас.%: дрожжевой экстракт 0,05- 0,1, картофель 15,0-20,0, капуста 10,0-20,0, глицерин 1,0-3,0, щавелевокислый калий 0,05-0,2, фосфорнокислый калий однозамещенный 0,05-0,2, сернокислый магний 0,03-0,07, вода остальное. Питательную среду засевают культурой гриба T.basicola, возбудителя черной корневой гнили хлопчатника и культивируют при 26°С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и О 00 ю ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 1/14, А 01 N 63/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4654357/13 (22) 10.01.89 (46) 15.11.91, Бюл. N 42 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений и Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А,В.Хотянович, P.М.Ильина, С.Ф.Сидорова, Н.В.Быкова и К,О,Атаханов (53) 632.9:576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 676610, кл. С 12 N 1/02, 1979.

Климова А,П, Известия АН Туркменской

ССР. Сер.Биол.науки, 1980, М 4, 77-78. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ДЛЯ ОЦЕНКИ ХЛОПЧАТНИКА НА УСТОЙЧИВОСТТЬ К ЧЕРНОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ (57) Изобретение относится к биотекнике и защите растений от болезней, в частности к способам. получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили. Цель изобретения — повышеИзобретение относится к биотехнологии и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона (ИИФ) при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили.

Цель изобретения — повышение выхода и патогенности инфекционного канала, Способ осуществля ют следующим образом;. Ж 1691392 А1, ние выхода и патогенности инфекционного начала. Способ заключается в следующем: готовят питательную среду следующего состава, мас.7: дрожжевой экстракт 0,05 — 0,1; картофель 15,0 — 20,0; капуста 10,0 — 20,0; глицерин 1,0 — 3,0; калий щавелевокислый 0,050,2; калий фосфорнокислый однозамещенный

0,05-0,2; магний сернокислый 0,03-0,07; вода остальное. Питательную среду засевают культурной гриба Т.bacicola - возбудителя черной корневой гнили хлопчатника — и культивируют при 26 С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и смешивают с двуокисью кремния и каолином в соотношении 1:3 — 1:4, причем двуокись кремния и каолин берут в соотношении 2:1, Полученным препаратом обрабатывают семена хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили.

Предлагаемый способ позволяет увеличить титр гриба с 48,7 до 190 млнlмл и обеспечить пораженность взрослых растений с

10,9 до 41,7, а всходов с 47,4 до 60,8 . 6 табл.

Готовят питательную среду следующего состава, мас. : дрожжевой экстракт 0,050,1, картофель 15,0-20,0, капуста 10,0 — 20,0, глицерин 1,0 — 3,0, щавелевокислый калий

0,05 — 0,2, фосфорнокислый калий одноэамещенный .0,05 — 0,2, сернокислый магний

0,03-0,07, вода остальное.

Питательную среду засевают культурой гриба Т.baslcola, возбудителя черной корневой гнили хлопчатника и культивируют при

26 С в течение 4 сут. Биомассу отделяют и

1691392 смешивают с двуокисью кремния и каолином в соотношении 1;3-1 .4, причем двуокись кремния и каолин берут в соотношении 2:1.

Полученный препарат обработки семян хлопчатника перед высевом с целью оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили (ЧКГ).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. 200 r (20%) мелко нарезанного картофеля и.150 г (15%) капусты заливают 1 л воды, доводят до кипения, кипятят

20 мин, фильтруют. В отвар вносят при перемешивании 0,5 r (0,05%) магния сернокислого, по 1 г (0,1%) фосфорнокислого однозамещенного калия и щавелевокислого калия, 20 г (2%) глицерина, 0,7. г (0,07%) дрожжевого экстракта и доводят объем до 1 л, В качалочные колбы емкостью 750 мл разливают по 100 мл приготовленной средь и стерилизуют.при 1 ати 30 мин

Стерильную рабочую среду инокулируют 48-часовой посевной культурой гриба, выращенной глубинно на качалке (200 об/мин), при 26 С. Норма засева 10%, Посевная среда состоит из картофельного отвара (200 г картофеля на 1 л воды), в который вносят 20 r (2%) глюкозы, 100 г (10%) аминопептида, 1 г (0,1%) дрожжевого экстракта.

Инфекционный материал выращивают на качалке (200 об/мин) при 26 С в течение

3 сут. Биомассу отделяют центрйфугированиеМ, смешивают ее с наполнителем в отношении 1:3 — 1:4 по сухому веществу и сушат в хорошо вентилируемом помещении при

37 С в течение 24 ч. В качестве наподнителя используют двуокись кремния и каолин в отношении 2:1. Увеличение количества каолина уменьшает влагоемкость и разрыхляющие свойства наполнителя. Полученный инокулюм применяют для создания ИИФ при оценке хлопчатника на устойчивость путем предпосевной обработки семян хлопчатника, Для этого увлажненные семена тщательно обваливают сухим препаратом из расчета 160 г препарата на 1 кг семян подсушивают их на воздухе и высевают.

Пример 2. Влияние компонентного состава среды на целевой продукт, Необходимость включения в среду каждого компонента обоснована данными табл.1. Предлагаемое сочетание компонентов питательной среды в указанных количествах увеличивает выход и патогенность инфекционного начала (варианты 9,10.11) по сравнению с известными средами, Кроме этого повышается качество биомассы, а именно, пигментация мицелия и оболочек конидий, формирование конидий, типичных

10

25

35

45

55 для вида по форме и размеру(до 70% вместо

20%).

Уменьшение содержания в питательной среде картофеля, капусты, глицерина, дрожжевого экстракта, солей калия и магния ниже 200, 100; 10, 0,5; 0,5; 0,3 г/л соответственно приводило к снижению выхода биомассы и эндоконидий, а повышение содержания перечисленных компонентов выше 200; 200; 30; 1; 2; 0,7 г/л вело к увеличению общей биомассы, но одновременно уменьшало количество эндоконидий в ней до 17 — 30%, повышало морфологическую неоднородность эндоконидий и снижало

5 синтез меланина.

Внесение щавелевокислого калия и отвара капусты способствует повышению выхода биомассы, а также стабилизации морфологического типа патогена, интенсивной пигментации мицелия и оболочек эндоконидий, что обеспечивает сохранение жизнеспособности и вирулентности материала в природных условиях. Последующее отделение биомассы и смешивание ее с влагоемким разрыхляющим наполнителем позволяют получить препарат для создания

ИИФ с содержанием 900 †12 млн. инфекционнь:.х единиц в 1 r препарата. B качестве наполнителя и прилипателя используют двуокись кремния и каолин в соотношении

2:1, что обеспечивает получение препарата в виде тонкого порошка, хорошо удерживающегося на семенах хлопчатника, и дает воэможность применять его для опудривания семян, сократив тем самым норму расхода биомассы гриба в 5 — 6 раз.

Каждый из этих компонентов несет определенную функциональную нагрузку; каолин повышает удерживаемость готового препарата на семенах хлопчатника, но пло..хо поглощает влагу, превращая отфильтрованную биомассу (пасту) в глину, Чтобы этого избежать, нужно увеличивать его количество, что ведет к снижению инфекционной нагрузки на семя. Двуокись кремния хорошо адсорбирует влагу, но может повредить клетки из-за быстрого их обезвоживания слабее, чем каолин, удерживается на

° семенах хлопчатника, что также снижает инфекционную нагрузку, Сочетание компонентов накопителя .двуокись кремния -- каолин в соотношении

2:1 придает целевому продукту качественно новые свойства: делит препарат более гомогенным, позволяет избежать упомянутых нежелательных последствий их раздельного применения, изменить способ применения препарата для создания ИИФ, удешевить продукт. значительно снизив норму внесения препарата на гектар, повы1691392

10

35

55 сив одновоеменно инфекционную нагрузку до 4 млн.инф. ед,/семя, увеличить срок хранения препарата до одного года.

Пример 3. Сравнительные резульгаты выращивания Т.basicola на среде по пред-ложенному способу и питательной среде, состоящей из морковного отвара, Морковную среду готовят в соответствии с методикой А.П. Климовой: 200 r моркови заливают 1 л воды, варят 40 мин, фильтруют. Фильтрат разливают по 100 мл в качалочные колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 1 ати 30 мин. Дальнейшее выращивание ведут согласно примеру 1.

Результаты представлены в табл.2.

Как видно из таблицы, при глубинном способе выращивания Т.basicola титр конидий в 10 раз выше, а биомасса в 3 раза больше, чем на известной морковной среде.

Пример 4. Рост различных штаммов

Т.baslcola на предложенной среде.

Получение препаратов осуществлялось так же, как в примере 1, патогенность оценивалась по проценту пораженных растений хлопчатника общепринятыми методами.

Пример 5. Получение препарата в производственных условиях.

Производственное выращивание культуры Т.basicola осуществляют в ферментерах емкостью 50 — 100 л, снабженных барботером и мешалкой (200 об/мин) на пи. тател ьн ой среде, содержащей, мас. : дрожжевой экстракт 0,1, картофель 20,0, капуста 20,0, глицерин 3,0, щавелевокислый калий 0,2,. фосфорнокислый однозамещенный калий 0,2, сернокислый магний 0,07, вода остальное. Коэффициент заполнения аппарата 0,6. Использован синтетический пеногаситель. Аэрация ступенчатая 0,3-1 объем воздуха (объем среды в 1 мин), Биомассу от культуральной жидкости отделяют сепарацией. В остальном технология получения и применения такая же, как описана в примере 1.

Инокулюм для засева производственной среды выращивают глубинно, на качалке (180-220 об/мин) в качалочных колбах емкостью 750 мл с объемом среды 100 мл или в 5-литровых бутылях с объемом среды

1 л. Количество внесенного посевного материала составляет 10% от объема производственной среды.

На данной среде гриб растет в виде пушистого, гомогенного, фактически неокрашенного мицелия. Выход биомассы составляет 6-28 г/л по сравнению с 3-6 г/л на картофельно-глюкозном отваре или других известных вариантах среды.

Пример 6, Сравнение препаратов, полученных предложенным и известным способами.

Для создания искусственного инфекционного фона применяют препарат, полученный при выращивании патогена глубинно на качалке в 5-литровых бутылях, содержащих 1 л питательной среды следующего состава, мас,7, : дрожжевой экстракт 0,05, картофель 15,0, капуста 10,0, глицерин 1,0,щавелевокислый калий 0,05, фосфорнокислый однозамещенный калий 0 05, сернокислый магний 0,03, вода остальное. Норма засева 10, Биомассу от культуральной жидкости отделяли сепарацией. В остальном технология получения и применения препарата, как в примере 1, Известный способ получения биапрепарата для.создания ИИФ включает поверхностное выращивание гриба на твердой среде, а именно: пшене, пропитанном картофельным отваром, содержащим дополнительно аминопептид и (или) дрожжевой экстракт, Глубинный метод культивирования гриба применяется только на стадии получения посевного материала для заражения пшена, Результаты сравнения препаратов приведены.в табл,5 и 6.

На полученном ИИФ прове ена оценка

19 сортов хлопчатника. При этом были получены четкие различия между сортами по степени восприимчивости к осенней форме проявления заболевания, что было невозможно на инфекционном фоне, созданном по известному способу.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить более гомогенный препарат для оценки хлопчатника на устойчивость к черной гнили с большей концентрацией инфекционного начала, чем известные ранее, применение которого позволяет обеспечить проявление осенней формы заболевания и снизить норму расхода препарата и затраты на его применение.

Формула изобретения

Способ получения препарата для оценки хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили, включающий выращивание гриба Thlelaviopsts baslcola на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и патогенности инфекционного начала, в среду дополнительно вносят картофель, капусту, глицерин, щавелевокислый калий, фосфорнокислый однозамещенный калий, сернокислый магний при следующем соотношении компонентов, мас. : дрожжевой экстракт 0,05-0,1; картофель 15,0-20,0; капуста 10,0 — 20,0; глицерин

1,0-3,0; щавелевокислый калий 0,05-0,2;

1691392

Таблица.1

Состав питательной среды, т/л

1Компоненты среды

Иавестные (увламнитель) Варианты сред

1 2 1 2 3, 4 5 6 7i . -8 9 10 11

Отвар, до 1 л:

Картофель

КапусФа

200

1ОО

200 200

150.з 200 (200

100 ° . 150 .200

О 5. 0,7 1,О

200

200

1 ° n елтид вой 9кстракт щавелево0,5 0,5

05 05

05 05 1О 20 и щавелево0,5

2О

20 го

1О

20 го

20 ЗО ин ительное ьное пита,И,Р ) са, r/ë онидия, 1,5

6,8

1 5

7,6

1,5

7,4

1 5

8,4

1,5 1В5

12,З 15,7

3 5

З,7

4,5

5,0 5,1 6,6

1,7

48 ° 7 18В7 Зозо 68В7 92,5 65 ° О 70,5 75,0

35,0 82,5 130,0 190>0 154,0 нность черной ой гнилью .2 ней вс)соды вврослые растение

47,4

60,8

10,9

41,7

Таблица 2

Таблица 3

Амине

Драим

Калий кисл

Глице

Допел минер ние (Биома

Титр м н./

Порам

Вор фосфорнокислый одноэамещенный калий

0,05 — 0,2; сернокислый магний 0,03 — 0,07; вода остальное, при этом процесс культивирования осуществляют глубинным методом при перемешивании, после культивирования биомассу гриба отделяют и вводят смесь двуокиси кремния и каолина в соотношении 2:1.

1691392

Таблица 4

Таблица 5

Содержание эндоконидий млн/г препарата

Способ выращивания патогена и субстрат

Норма внесения препарата. кг/га

Способ применения

Пораженность черной ко невой гнилью

Вариат

Осенняя форма поражения,$

Корневая гниль всходов, $, 60-80

35,8-75,4

Известный способ

10,9

Внесение в почву

Поверхностный на твердой среде— пшене,обога щенном азотом

Глубинный на жидкой среде предлагаемого состава

10-15:

41,7

900-1250

60,8

Предпосев ная инокуляция семян

Предложен ный способ

Таблица 6

Составитель Ю.Рогачев

Редактор M.Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор О.Ципле

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Заказ 3907 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5