Способ получения рестриктазы т @ 201 @

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов PuGATCPy. С целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Thermus ruber BKM B-1723 D, а хроматографическую очистку ведут последовательно на фосфо целлюлозе и гепарин-сефарозе. Выход рестриктазы Fru 201 . составляет 100 ед./г биомассы. Идентична рестриктазе Xho II и во всех генно-инженерных работах может заменить ее. со XI О СО о 00 XI ком. хроматографическую очистку фермента 1. а также аналогичный способ получения рестриктазы Tth HB 8 из Thermus thermophilus HB 8 2. Однако использование этих способов не позволяет получить рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов PuGATCpy. Известны также способы получения ре-- стриктаз. узнающих и расщепляющих последовательность нуклеотидов PuGATCPy.

С, 10 1 < О I Е Т С К И Х

СО, ИА: laic ГИ IE0ÊÈÕ

Р Е С!1) ) I 1 Ê

I ОСУДАРСТ BEt 1НЕЯИ КОМИ I Å!

f10 ИЗОЬРЕ! ЕНИЯМ И Oti:Ð ТИЯМ

11РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4775745/13 (22) 29.12.89 (46) 07.01.92. Бюл. М.. 1 (71) Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научно-производственного обьединения "Вектор" и Институт микробиологии АН СССР (72) И.А.Цаплина, T.И.Богданова. Н.И.Речкунова и С.X.Äåãòÿðåâ (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Sato SÄ Hutchinson C„Harris l,i, Thermostable Sequence specific endonuclease from

Thermus aquaticus. Aoc. Natl, Acad. Sic, USA, 1977, v.-74, М 2, р. 542-546.

2. Sato S., Shinomiya T. Au Isochizomer of

Tag 1 brom Thermus thermophilus НВ 8. 1.

Biochem, 1978, ч. 84, N 5, р. 1319-1321.

3. Hiraoka N. Kita К., Nakajima Н. Purificationn and characterization of sequence — Specific

restriction endonuclease Mfll. 1.Ferment.

Technal„v. 62, N. 6, р. 583-588.

4. Крамаров В.М., Мазанов А.Л., Смо !янинов В.В. Выделение второй сайт-специфической эндонуклеазы из Xanthomona

hoIcicola и ее характеристика.— Биоорганическая химия, 1982, т. 8. N. 2. с. 220-223.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. в частности к получению эндонуклеазы рестрикции. способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов PuGATCPy.

Известны способы полу <ения рестриктаз из микроорганизмов. относящихся к роду Thelmus, например способ получения рестриктазы Taq I из штамма Thermus

aquaticus, включающий культивирование штамма, разрушение биомассы ультразву„„Ь0„„1703687 А1

«I)s С 12 N 9/14//(С 12 N 9/14. С 12 R 1.01) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ

TRU 201 ( (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов PuGATCPy. С целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Thermus

ruber ВКМ В-1723 О, а хроматографическую очистку ведут последовательно на фосфо целлюлозе и гепарин-сефарозе. Выход рестриктазы Fru 201 .(составляет 100 ед./г биомассы. Идентична рестриктазе Xho 11 и во всех генно-инженерных работах может заменить ее. ком. хроматографическую очистку фермента (1). а также аналогичный способ получения рестриктазы Tth НВ 8 из Thermus thermophiIus НВ 8 (2).

Однако использование этих способов не позволяет получить рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов PuGATCpy.

Известны также способы получения ре-стриктаз, узнающих и расщепляющих последовательность нуклеотидов PuGATCРу, 1703687

/ ) например способ получения рестриктазы

Mfe из Microbacterium flovum, включающий наработку биомассы, получение грубого экстракта, фракционирование сульфатом аммония и хроматографическую очистку фермента на трех сорбентах с выходом 300 ед./г биомассы (3).

Недостатком данного способа является длительность процесса очистки фермента.

Кроме того, рестриктаэа Mfe не гидролизует

ДНК, содержащую 6-метиладенин в последовательности GATC, т.е, является чувствительной к метилированию dam-метилазой, что требует дополнительных затрат по получению неметилированной ДНК, Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения рестриктазы Xho II иэ Xarithomorias holcicola (4), Данный способ включает наработку биомассы. получение грубого экстракта с последующей хроматографической очисткой на фосфоцеллюлоэе (хроматография и рехроматография) и аминогексилсефарозе.

Однако используемый в известном способе штамм — продуцент содержит еще одну рестриктазу Xho f, что усложняет процесс очистки фермента, требует рехроматографии на фосфоцеллюлозе, К недостаткам данного способа также относится крайне низкий выход целевого продукта — около

100 ед./r биомассы (4000 ед. из 30 г).

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого п родукта.

Способ заключается в том, что используют штамм термофильной бактерии

Thermus ruber BKM B-17230 (ВС-201), продуцирующий единственную рестриктазу

Tru 201 f c повышенным ее содержанием.

Штамм культивируют на питательной среде, клетки разрушают ультразвуком и проводят очистку фермента путем хроматографий на фосфоцеллюлоэе и гепарин-сефарозе.

Пример, Культивирование штамма и получение биомассы.

Клетки Thermus ruber ВС-201 высевают из ампулы на твердую среду, содержащую

20 картофельного отвара, 0,57ь пептона и

0,02 дрожжевого экстракта, инкубируют в течение 1 сут при 60 С, затем вносят петлей в 100 мл жидкой среды того же состава и выращивают в течение 24 ч при 60 С. Полученный инокулят вносят в 2 л жидкой среды того же состава и выращивают при 60 С в течение 14 ч на качалке при 60 об/мин. После охлаждения клетки собирают центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Выход сырой биомассы 1 г с 1 л среды.

Получение и очистка рестриктазы

Tru 201 (.

2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02

М буфера трис- ICI, рН 7,5, содержащего

10 М Р--меркаптоэтанола и 0,1О тритона

X-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость наносят на 20 л фосфоцеллюлоэы P-II (Whatmari), уравновешенной буфером А (0,02 M К-фосфат, рН 7,5, 0,001 М j3-меркаптоэтанол, 5 10 ЭДТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения

УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют 240 мл градиента 0-1,0 NaCI в буфере А. Объем каждой фракции 8 мл. Аликвоту иэ каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 60ОC с 1 мкг ДН К фага А и анализируют в геле аг ipoэы. Фракции, расщепляющие ДНК фага л (21 — 23), объединяют, диализуют 4 ч против

2 л буфера А и наносят на колонку объемом

5 мл с гепарин-сефарозой (Pharmacia). Элюцию проводят линейным градиентом NaCI

0 — 1,0 М в буфере А объемом 60 мл. Объем фракций 2 мл. Фракции (16, 17), содержагцие

Tru 201 i, объединяют и диализуют против буфера Ас 507 глицерина, Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность

2000 ед./мл.

3а единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 65 С.

Ферментный препарат хранится при—

20 С. Из 1 г биомассы получают 1000 ед. рестриктазы Tru 201 f.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Tru 201 I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Tru

201 f, проводят гидролиз ДНК фага Т7 рестриктазами Tru 201 и Xho II по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Tru 201 i и Xho II порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Tru 201 является пзошизомером Xho II, узнает и расщепляет последовательность PuGATCPy.

Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: упрощает процесс получения целевого фермента (сокращается число стадий), обеспечивает выход целевого фермента в 8 раз выше.

Поскольку рестриктаза Tru 201 1 имеет сайт узнавания. идентичный сайту Xho II.

1703687 она может заменить эту рестриктазу во всех генно-инженерных работах.

Сос эвитель Л. Юшкова

Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Редактор Л. Волкова

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ получения рестриктаэы Tru 201 Г включающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, отделение клеток и разрушение их ультразвуком с последующей постадийной хроматографической очисткой на сорбентэх— фосфоцеллюлоэе и производном сефарсэы. отличающийся тем, что. с целью упрощения процесса и повышения выхода

5 целевого продукта. в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм

Thermus ruber ВКМ В-1723D, а при хроматографической очистке в качестве производного сефарозы берут гепарин-сефарозу.