Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1 ,д@@Яфй

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4724816/13 (22) 27,07.89 (46) 15.12.91. Бюл. N. 46 (71) Научно-производственное обьединение

"Биолар" и Научно-производственное обьединение "Вектор". (72) Ю.Н.Бойков, B,Е.Репин, С.Х.Дегтярев и Н.В.Бойкова (53) 577.15(088,8) (56) Аркадьева 3.А., Трифонова Т.В., Агапова Н.С. и Козлова Е.И, — Научн. докл, высшей школы биол. науки, 1976. N7,,с. 113-115, Gingегоs T,R., Greenough L„Lehi}dkraut

I., Roberts R, j. Two new restriction endonucieases from Protew vulgar - J. Nucleic

Acids Res„1981, vol. 9, ¹ 18, р. 4525-4536. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВ А Н И Я ШТАММА PSEUDDViQNAS

STUTZERl ВКПM В-4727 — ПРОДУЦЕНТА

РЕСТРИКТАЗЫ PSU l (57) Изобретение относится к микробиологии и касается состава питательных сред, Изобретение относится к микробиологии, в частности к составам питательных сред, предназначенных для культивирования продуцентов рестриктазы PSU l.

Цель изобретения — повышение выхода фермента и его активности.

Сущность изобретения заключается в

ТоМ, что питательная среда для культивирования продуцента рестриктазы — штамма

Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 содержит s качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат и минеральные соли.

„, Й2„„1698286 Al (я)5 С 12 К 1/20, 9/22//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:38) гредназначенных для культивирования гродуцентов растриктазы Psu l, С целью повышения выхода фермента и его активности предлагают использовать для выращивания продуцента рестриктазы Psu i—

Pseudomonas stutzeri ВКПМ вЂ” 4727 питательную среду, содержащую в качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат с содержанием, %; общий азот 11,2; аминный азот 6,7; зола 9;7; влажность 4,1, при следующем соотношении компонентов, г/л: панкреатический гочечный гидролизат 15,020,0; аммоний сернокислый 1,0 — 2,0; натрий лимоннокислый 0,5-0,7; хлористое железо

0,001 — 0,002; вода до 1 л. При этом выход биомассы достигает 12,5 — 13,0 г/л культуральной жидкости, выход ре триктазы

10000 — 15000 ед,/г биомассы, а активность увеличивается до 125000 — 195000 ед./л культуральной . жидкости. что в 2 — 5 раз превышаетаналогичные показатели на известной сре,де. 1 табл, Панкреатический почечный гидролизат производят путем ферментативного гидролиза отходов (в данном случае почек животных) с последующим высушиванием на распылительной сушилке.

Панкреатический почечный гидролизат представляет собой порошок светло-коричневого цвета. Он богат важными жизненно необходимыми элементами для нормального роста, развития бактерий, проявления биосинтетической активности, Почечный гидролизат содержит, : общий азот 11,2; аминный азот 6,7: зола 9,7; влажность 4,1. Кроме того, так как в почках

1698286 живогных содержатся и другие биологически активные вещества (витамины, микроэлементы и др.), то при приготовлении гидролизата, он обогащается этими веществами.

Введение панкреатического почечного гидрализата способствует активизации роста, стимулированию жизнедеятельности бактерий и накоплению рестриктазной активности.

Введение сернокислого аммония способствует дополнительному плтанию бактерий аминным азотом и серой. В качестве источника углеродистого питания в питательную среду вводят лимоннокислый натрий.

В результате совместного использования лимоннокислого натрия и сернокислого аммония происходит поддержание рН во время выращивания культуры в оптимальных предзлах (7,2). Ионы натрия совместна с ионами железа, входящими в состав хлорида железа, воздействуют на дыхательные центры бактерий.

При введении пакреатическаго почечного гидролизата в количествах менее 15,0 г/л (например, 12,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так ак не хватает аминного азота для роста и развития бактерий

Рseudomonas stutzeri и, соответственна, для биосинтеза рестриктазы Psu I, При введении панкреатического почечного гидролизэта в количествах балee 20,0 Г/л (например, 22,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так как происходит репрессия раста бактерий и биосинтезэ рестриктазы Psu I.

При введении сернокислага аммония в количествах менее 1,0 г/л (например, О 5 i-/л происходит снижение выхода биомассы и рестриктэзы Ры I, так кэк количества ионов аммония н",,дсстэточно для подщелачивания среды и поддержания рН. При введении сернокислого аммочия в количествах более 2,0 г/л (например, 2,5 г/л) снижается выход биомассы и рестриктазы Psul, так как происходит ингибираванAe роста бактерий M 6liocMHTeзэ фермента.

При введении лимоннокислога натрия в количествах менее 0,5 г/л (например, 0.4 г/л) происходит снлжение выхода биомассы бактерлй и рестриктазы Psu I вследствие того, чта не хватает ионов натрия в среде для активации клеточного дыхания бактерий. Введение лиманнокислаго натрия в количествах более 0,7 г/л (например.

0,8 г/л) вызывает снижение выхода биомассы бактерий и рестриктазы Рва I, тэк кэк происходит ингибирующее воздействие на дыхательные центры клеток.

Введение хларида железа,в количествах менее 0,001 г/л (например, 0,0005 гlл) приводит к снижению выхода биомассы и рестриктазы Psu I, так как не хватает ионов

5 железа в среде для активации клеточного дыхания бактерий и ионов хлора для питания куль;уры, При введении хлорида железа в количествах более 0,002 г/л (например, 0,0025 ",/ë) происходит снижение выхода

10 биомассы бактерий и рестриктазы Psu I вследствие того, чта происходит репрессивн-; воздействие на дь,хательные центры и избыток ионов хлора ингибирует рост, развитие и биосинтетическую активность куль15 Tvpbi

Пример 1, Питательная среда содержи1 г/л

Пэнкреатический почечный гидр олизат 20,0

20 Сернокислый амманий 2,0

Лимоннокислый натрий 0,7

Хлорид железа 0,002

Вода До 1,0n

Оживление штамма Pseudomonas

25 stutzer< 131 ВКПМ В вЂ” 4727 осуществляют на сухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л; вода 1,0 л) в чашках

Петри. Инкубируют в термокамере при 28 С в течение 24 ч, 30 С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалачные колбы с. питательной средой данного состава, рН 7.,2.

Выращивают посевной материал при

35 28 С в течение 18 ч на качалке,.

Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН 7,2, температуре 28 С, перемешивании

200 об/мин, подаче воздуха: 2 сбъема ваз40 духа на 1 обьем питательной среды, выращива от до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,7 опт,ед. (ЗЭК, фильтр N 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 13,0 г/л культуральной

45 жидкОСти.

Выход рестриктазы Psu I 15000 ед,/г биомассы; .95000 ед./г культуральной жидкости.

Для определения активности фермента

50 используют метод электрофсреза в геле.

Активность фермента определяют в грубом экстракте биомассы бактерий

Рвeudomonas stutzeri 131 ВКПМ В вЂ” 4727 и в,îíöå выделения (после хроматографии на

5 колонке g фосфоцеллюзай).

За единицу активности рестриктазы

Psu Iп,ринимают минимальное количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага л. в течение 1 ч при 37ОС, 1698286

Выделение фермента проводят следу.ощим образом.

50 г биомассы бактерий Pseudcmonas

stutzeri суспендируют в 100 мл 10 м1Л трисНС)-буфера, рН 7,2, содержащего 0 <;,Ì 2меркаптозтанола, 1 мУ, азида натри, 1 м1.1 трилона Б (буфер А), и доводят зтим же буфером дс об ема 150 мл, К суспензии добавляют 1," мл 10%-ного.тритона X-100 и

150 мгл лизсцима. Лизис проводят ч пр" постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения, Полученный лизат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл l5 -ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного водного раствора полизтиленгликсля (ПЗГ) и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси

6,5), Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге

"Hlqh speed" (20000 g 20 мин), Верхнюю

ПЗГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным обьемом буфера А, добавляют тритон

Х вЂ” 100 (0,1%-ный) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-ный тритон Х100 (буфер Б), Фермент элюируют 0-1,0 M линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Psu I, концентрируют диализсм против буфера Б, содержащего

55 -ный глицерин.

Получают очищенный фермент Psu (в виде прозрачной бесцветной жидкости.

Рестриктаза Psu 1 расщепляет ДНК фага Л на 3 сайта, Содержание неспецифических экзо- и эдонуклеаз после выделения отсутствуют.

Хранят рестриктазу Psu l при -10 С в течение 1 года.

Пример 2. Питательная среда, содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидролизат 17,5

Сернокислый аммоний 1 1

Лимсннокислый натрий 0,6

Хлорид железа ОЯ015

Вода До 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 12.75 г/л. культуральной жидкости, Выход рестриктазы Psul 12500 ед,/г биомассы; 160000 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществляют аналогично примеру 1, Пример 3, Питательная среда содер жит, r/л:

Панкоеатический почечный гидролизат 15,0

5 Сернскислый аммоний 1,0

Лимоннокислый натрий 0,5

Хлсрид железа 0,001

Вода До 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию

10 кул ь.| уры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично r,римеру 1.

Вь:.".oä биомассы 12,5 г/Ji культуральной жидкости.

15 Выход рестриктизы Psu 10000 ед./ биомассы; 125000 ед. /л культурал ьной жидкости, Определение активности, выделени-= фермента Psu l и хранение осуществляют

20 аналог очно примеру 1.

Пример 4, Питательная среда содержит, г/л:

Панкреатический почечный гидоолизат 12,5

25 Сернокислый аммоний 0,5

Лимоннокислый натрий 0,4

Хлорид железа 0,0005

Вода До 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию

30 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 5,1 г/л культуральной жидкости.

35 Выход рестриктазы Psu l 2300 ед,/г бис" массы; 11730 ед./л кул ьтуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществл;от как в примере 1, 40 Пример 5, Питательная среда содержит, г/л;

Панкреатический почечный

Гидролизат 22,5

Сернскислый аммоний 2,5

45 Лимоннокислый натрий 0,8

Хлорид железа 0,0025

В ода До 1,0л

Выращивание биомассы: адаптацию . ку> ьтуры, инокуляцию посевного материа50 ла, ферментацию культуры проводят как в примере 1.

Выход биомассы 5,7 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Psu (3100 ед,/г

55 биомассы.

Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществляют как в примере 1, Пример 6, В таблице представлены данные по сопоставительному анализу вы1698286

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования штамма Pseudomonas stutzeri ВКПМ В—

4727 — продуцента рестриктазы Psu включающая источник аминного азота, ми15,0 — 20,0 1,0-2,0

0,5-0,7

0,001-0,002

Да1л

Питательная среда

П редл а гаемая ая е, г/л

0,0 трий 5,0 а 1,0л

Панкреатический почечный гидролизат 2

Сернокислый аммоний 2,0

ЛMMOHPIOKViCnblA HBTpNA 0,7

Хлорид железа 0,002

Вода 1,0 л массы ной жидкости иктазы амассы; льной жидкости

12,5-13.0 г/л культуральной жидкости

10000-15000 ед./г биомассы;

125000-195000 ед./л культуральной жи кости

Составитель В. Саина

Техред M.Ìoðãåíòàn Корректор И. Муска

Редактор А, Огар

Заказ 4367 1 ираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета па изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101 ращивания штамма продуцента Pseudomona stutzeri ВКПМ В-4727 на известной и предлагаемой средах, При выращивании на предлагаемой среде продуцента рестриктазы Psu 1—

Pseudomonas stutzet i ВКПМ В вЂ” 4727 выход биомассы бактерий возрастает в 2 раза, а выход и активность рестриктазы увеличиваются в 3 — 5 раз по сравнению с известной средой, неральные соли и воду, о т л и ч а ю щ а яс я тем, что, с целью повышения выхода фермента и его активности, в качестве источника аминного азота среда содержит

5 панкреатический почечный гидролизат. а в качестве минеральных солей — сернакислый аммоний, лимоннокислый натрий и хлористое железо при следующем соотношении компонентов, в г/л:

Панкреатический почечный гидролизат

Аммоний сернокислый

Натрий лимоннокислый

Хлористое железа

Вода