Штамм культивируемых клеток растений liтноsреrмuм сryтнrоrнirоn siев ет zucc - продуцент шиконина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской , пищевой и парфюмерной промышленности. Цель изобретения - получение каллусного штамма воробейника краснокорневого, продуцирующего шиконин. Каллусный штамм воробейнике крзснокорневого ВК-39 получен в результате селекции калуссов корневого происхождения. Ростовой индекс культуры 15, содержание шиконина5-6% от сухой массы клеток. 1 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

isi>s С 12 N 5/04, 5/00

ГОГУДАРСТСЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4822723/13 (22) 16.04.90 (46) 23.01.92. Бюл. гв 3 (71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР и Тихоокеанский институт биоорганической химии

Дальневосточного отделения АН СССР (72) Ю.Н.Журавлев, В.П,Булгаков, Н.Ф.Писецкая, М.M.Коэыренко, Т.В.Старун, А.А.Артюков и С,А.Федореев (53) 578.035.23 (088.8) (56) Laughlin Th g. — Biotechnology, 1987, ч.

5, р. 1035.

PlzukamI et al. — PhytochemIstry, 1987, ч, 16, р. 1183-1186, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Шиконин обладает бактерицидным, противоопухолевым, ранозаживляющим и антиоксидантным действием; за рубежом используется в медицине, а также в парфюмерии и пищевой промышленности. В Японии воробейник краснокорневой выращивается на плантациях, при этом в течение 5-7 лет в его корнях накапливается до 2 шиконина. В настоящее время в Японии освоено биотехнологическое получение шиконина (1l.

Известно, что за рубежом получены каллусные культуры растений воробейника краснокорневого, продуцирующие шиконин. В этих культурах содержание шиконина колеблется в пределах 1,7-2,5 ь от сухой массы каллусов (2).

Описание каллусных культур, их характеристик в литературе отсутствует, также

„„5IJ „„1 707073 А1 (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ LITHOSPERMUM

ERYTHR0RHIZQN SIE B, ET ZUCC — ПРОДУЦЕНТ ШИКОНИ»А (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности. Цель изобретения — получение каллусного штамма воробейника краснокорневого, продуцирующего шиконин, Каллусный штамм воробейника краснокарневого BK-39 получен в результате селекции калуссов корневого происхождения. Ростовой индекс культуры 15. содержавшие шиконина 5-6;ь от сухой массы клеток. 1 табл, отсутствуют ссылки на депонирование штаммов — продуцентов шиконина в доступных коллекциях.

Цель изобретения — получение штамма культивируемых клеток воробейника краснокорневого, продуцирующего шиконин, Такой штамм получен в Биолого-почвенном институте ДВО АН СССР и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений при Институте физиологии растений СН СССР им. К,А.Тимирязева под номером BCKK (BP) N 36. Наименование штамма — В К-39.

Штамм BK-39 характеризуется следующими признаками.

Исходный материал: корень дикорасгущего растения воробейник краснокорневой (Lithospermum crythrorhlzon Sieb. et

Zucc,), заготовленный в Партизанском районе Приморского края в 1986 г. Для посадки в культуру in vitro отобран корень интенсивно-красного цвета диаметром 20

1707073 кгеток

22

14

13

Число хромосом

28

36

42

48

Способность к морфогенеэу.

Редко наблюдается спонтанный ризогенез. мм. Эксплантаты изолироеа и из корневых дисков толщиноЙ 2 — 3 мм, Культуральные свойства.

Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции красного цвета. Ростовой индекс 15 для каллусов начальной массой 150 кг, содержание сухого вещества 5,8 — 6,0 от сырой биомассы. Способ культивирования — выращивание в накопительном режиме при отсутствии освещения при 25 + 1 "С, относительной влажности воздуха 70 107ь на питательной среде следующего состава, мг/л воды;

NH4N03 350 — 450

KNOT 1500 — 2300

КН2Р04 150 — 190

CaCl 6Н20 590 — 680

Mg 504 7Н20 350 — 400

НзВОз 4,2 — 8,0

l1п S04 4Í20 15,6 — 26,7

CoClg 2HzO 0,02 — 0,03

CuSOn 5Н20 0,07 — 0,08

ZnSO4 7Н20 6,0 — 10,3

И а УоОл 2Н:0 0,2 — 0,3

Kl 0,53 — 0,90 .feSO< 7НзО 25,0 — 30,5

Гидрохлорид тиамина 0,15 — 0,25

Гидрохлорид пиридоксина 0,4 — 0,6

Никотиновая кислота 0,4 — 0,6 мезо-И нозит 80 — 120

Индолилуксусная кислота 0,15 — 0,25

Кинетин 1,5 — 2.5

Сахароза 25 — 35 г

Агар 5.8 — 6,2 г

Динатриевая соль ЭДТА 33,6 — 41,0 причем рН сред до автоклавирования 5,6—

5,8.

Номер пассажа 35-й, пассивирование каллусов проводят с интервалом 25 сут, сбор каллусов для получения иэ них шиконина — после 35 сут культивирования.

Цитологическая и кариологическая характеристикаа.

Ткань содержит клетки овальной формы среднего размера 40 28 мкм, Максимум митотической активности наблюдается на 6-й день культивирования. Распределение клеток по числу хромосом следующее:

Характеристика биосинтеза шиконина.

Содержание шиконина в каллусах увеличивается параллельно с ростом культуры и достигает 5 — бф, от сухой биомассы на

5 35-й день культивирования, Достигнутый уровень продуктивности стабильно сохраняется при пассивировании культуры в течение 2 лет. Шиконин накапливается только в клетках и в среду не выделяется.

Пример. В колбы Эрленмейера емкостью 100 мл разлили по 30 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:

Н Н4й10з 400

15 КИОз 1900

КН7РО4 170

СаС!р 6Н20 655

М9S04-7Н20 370

НзВОз 6,2

20 MnS04 4НрО 22,3

CoCI2 2Н20 0,025

CuSO4 5НрО 0,075

ZnS04 7Н20 8,6 г" а; ."оОл. 2Н 0 0,25

25 Kl 0,83

FeS04 7Н О 27,8

Динатриевая соль ЭДТА 37,3

Г«gpoxnoð«ä тиамина 02

Г«дрохлэрид пиридоксина 0,5

30 Никотиновая кислота 0.5 ме 30- 1нозит 100 ."нд. л.л..;ксусная ки "лота 0.2

Г«нет«H 2

С. p.-. 20ООО

35 Агар 6000 рН =- 5, — 5.8.

Колбы со средой автоклавирсвали пои

117 С в течение 20 мин, затем охлаждали.

На поверхность агара помещали каллусы

40 штамма ВК-39 — no три инокулята массой

150 мг в каждую колбу. Культуры инкубировали в темноте при 25ОС и относительной влажности воздуха 707ь в течение 35 сут, Затем каллусы извлекли из колб и взвесили

45 (данные в таблице). После сушки каллусов в течение б ч под током горячего (50 С) воздуха в них определяли содержание шиконина.

Для этого каллусы иэ каждой колбы отдельно измельчали в ступке. Точную навеску (в

50 пределах 30 мг) экстрагировали гексаном в соотношении 1:100. Агиквоту экстракта в количестве 25 мкл разбавляли гексаном до

900 мкм, затем добавляли 100 мкл раствора

KOH. Оптическую плотность растворов эа55 меряли при длине волны 622 нм на спектрофотометре, .концентрацию шиконина определяли по калибровочному графику.

Содержание шиконина в пробах составило

5,5 — 5,8$.

1707073

Составитель Ю.Журавлева

Редактор И.Дербак Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор В. Г и р н я к

Заказ 241 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент-", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

В таблице представлены данные исследований содержания шиконина в кэллусах штамма ВК-39.

Полученный штамм BK-39 каллусной культуры воробейника краснокорневого позволяет при выращивании на одной питательной среде получить одновременно с хорошим ростом высокое содержание шиконина. Содержание шиконина в клетках штамма BK-39 в 2 — 3 раза превышает его содержание в корнях интактного растения.

Формула изобретения

5 Штамм культивируемых к",åòîê растений Lithospermum erythrothizon Sleb. ec

Zucc. — ВСКК (BP) hk 36 — продуцент шиконина.