Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может использоваться в клеточной селекции люцерны при создании нового исходного материала. Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3-4 ч облучают ультрафиолетом , затем промывают 3-4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрия в количестве 1,25-1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению. 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4727751/13 (22) 07.08.89 (46) 30,10,91. Бюл. ¹ 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт кормов им.В.Р,Вильямса (72) В.В.Мазин и Б.А.Тургунбаева (53) 578.085.23 (088.8) (56) Croughan Т.P. et.al. Selection of a NaCI
tolerant line of cultused alfalfa cells.Crop.Sci, 1978, ч.б, ¹ 18; р.959, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ЛЮЦЕРНЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может испольИзобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может быть использовано в клеточной селекции при создании нового исходного материала, в частности в клеточной селекции люцерны.
Цель изобретения — повышение солеустойчивости растений.
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве исходного материала используют среднеазиатские сорта люцерны.
В качестве эксплантата берут листья, растения предварительно стерилизуют в 0,1 ном растворе диоцида, Каллусную культуру получают на среде Гамборга В5, содержащей дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4—
Д) 8 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК)
0,5 мг/л, кинетин (КИН) 8 мг/л. Клеточную суспензию получают на жидкой питательной среде с фитогормонами 0,5 мг/л 2,4-Д и
0,5 мг/л КИН. Полученную клеточную суспенэию подвергают ультрафиолетовому облучению, которое проводят в асептических
„„5Ц „„1687139 А1
Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3 — 4 ч облучают ультрафиолетом, затем промывают 3 — 4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрйя в количестве 1,25 — 1,67 при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению, 4 табл, условиях в чашках Петри на расстоянии 1520 см от источника облучения с длиной волны 304-410 нм. После облучения клетки промывают 3 — 4 раза питательной средой при рН 5,8 с последующим определением их жизне- и эмбриогенной способности, Клеточную суспензию с жизнеспособностью выше 30 переносят на селективную питательную среду, содержащую комплекс солей. Суспензию, выдерживающую высокие концентрации комплекса солей, культивируют 3-4 пассажа по 25-30 дн, после чего получают эмбриоиды и растения-регенеранты. Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Для мутагенного воздействия УФ-облучения используют суспензии, содержащие не менее 800 тыс.клеток в 1 мл с жизнеспособностью 85-95 Если в суспенэии имеются клеточные агрегаты, то их предварительно отфильтровывают через сетку для получения гомогенных клеточных 1687139 Таблица! Время об- Количество лучени, живых клеч ток в 1 мч Х от контроля ичество Х от конт86 4 78 г,! 6453,9 30+2,6 15215, 6 76„4,1 38+2,5 Эмбриогеннан ткань 95,5 81,О 71,О ЗЗ,0 113 56 Кдиннчные клетки 90+1, 6 1З4 З,5 1ОО 100 Контроль Та блиц а 2 -: Т Ко нцентПри обработке Бее обработки УФ ПрВ ме! содержание соли (рация солей NaC1, Na Ю...Z Х NaC1 Ns S0 Индекс аиэнесл роста 1 собность Инде рост иа неспообность, Х атм. L. т 2, 9 М,5 78 0,35:0,70 3,3 0,4 70 0,49:0,97 3,4 0,3 81 0,70:1,38 1,0 0,6 39 7,0т0,5 Некров 78 ЗН 24 Некроа Ко нтооль 1,46 г 6,5 11 суспензий, которые разливают по 15 мл в чашки Петри в условиях асептики. Промывку повторяют 3 — 4 раза, После этого определяют жизнеспособность и эмбриогенную способность (табл.1). 5 Пример 2. После облучения промытые клетки переносят в селективную питательную среду Гамборга 88, содержащую смесь солей сульфата и хлорида натрия (табл,2). Как видно из табл,2, ультрафиолетовые 10 лучи повышают жизнеспособность клеток люцерны, Наиболее высокий индекс роста и жизнеспособность на 25-е сутки культивирования наблюдают при облучении и концентрации солей 1,5% что в 2,1 раза выше, 15 чем у необлученных клеток, а при концентрации соли 1 индекс роста и жизнеспособность практически не отличаются от контроля. При концентрации солей 2% жизненная функция клеток ингибируется. Та- 20 ким образом. ультрафиолетовое облучение увеличивает выход клеток, устойчивых к действию комплекса солей, fl р и м е р 3. Для доказательства интервальных значений приводится табл,3, где 25 ингибирование жизненных функций культуры ткани люцерны наблюдается при соотношении солей от 0,42:0,83 до 0,56: 1I,11 или от 1,25 до 1,67%. Пример 4, Облученные ультрафиоле- 30 товыми лучами клетки промывают в стерильной питательной среде в условиях асептики. Действие кратности промывок в стерильной питательной среде при рН 5,86,0 на плотность и жизнеспособность кле- 35 ток люцерны иллюстрируется в табл,4, из которой видно, что на 6 день после 3— - 4-кратной промывки наблюдается наиболее высокая жизнеспособность. При увеличении числа промывок жизнеспособность изменяется слабо. После 3-4 пассажей на селективной среде отбирают устойчивые к смеси солей клеточные линии люцерны, получают растения-регенеранты, 40% которых выдерживают сильное засоление в природных почвенных образцах с преобладающим сульфатно-хлоридным типом засоления, Получены семена от растений-регенерантов в условиях комплексного засоления. Формула изобретения Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны, включающий получение каллуса из эксплантатов, получение из каллуса суспензии клеток и перенос ее на селективную питательную среду с последующим получением растений-регенерантов, отличающийся тем, что, с Целью повышения солеустойчивости растений, перед переносом на селективную питательную среду на суспензию клеток воздействуют ультрафиолетовым облучением в течение 3 — 4 ч, после чего облученные клетки промывают 3 — 4 раза стерильной питательной средой с рН 5,8 — 6,0 в условиях асептики и в качестве селективного агента используют смесь солей сульфата и хлорида натрия в концентрации 1,25 — 1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению, 1687139 Та блица 3 Концентрация Содержание соли 7 от контроля Индекс роста солей NaC1 и Ма 80,7 атм z Таблица 4 Без промывки Промывка Срок, сут Плотность шт (мг) жизнеспособность, Ж 1-2 раза 3-4 раза 5-6 раз 5. 241, 1/30, 2 240, 6/23, О 243, О/16,5 243,6/единичные клетки 241,3/33, О 240,6/35,0 249,2/33,2 242,2/32,8 245,4/33,2 259,8/45,8 268,6/55,4 277,2/57,2 246, 6/33, О 260,4/45,6 263,2/55,8 278,2/59,0 ° 3 Составитель В.Демкин Редактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Ко ектор Л.Бескид Тираж Подписное Заказ 3655 етениям и открытиям при ГКНТ СССР ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откры 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Пате "Патент"„г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Контроль 0,21 0,42 0,63 0,83 1,05 1,25 1,46 1,67 1,88 2,09 2 4 6 8 10 0,07:0,14 0,14: 0,28 0,21: 0,55 0,28; 0,55 Оэ 35: Оэ 55 0,42: 0,83 0,49: 0,97 0,56:1,11 0,63:1,25 0,70:1,39 7, О+0,5 Некроз Некроз 62,8 74,3 78,5 52,8 40,0 21,4 22,8 22,2
