Ферментный электрод для иммуноферментного анализа

 

Изобретение относится к биохимии и иммунологии, и может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний . Целью изобретения является обеспечение возможности определения содержания антител или антигена в анализируемых образцах для диагностики различных заболеваний, в частности алеутской болезни норок. Поставленная цель достигается тем, что в мембрану известного ферментного эле/трог дополнительно сведен антиген или антитела в количестве 0,33- 0,66. мае.%, Чувствительность определений содержания составляет 5,3х х11Гсмоль/л, время определения 15 мин время жизни мембраны 31 су т. 1 ил. а &

09) ИИ союз сожтсних

СОЦИАЛИС ИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 G 01 N 27/ 3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

t

t к

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

1 (21) 4766894/25 (22) 05.07.89 (46) 23.01,92. Бюл, H 3 (71) Казанский государственный университет им. R.И. Ульянова-Ленина (72) Э.П. Медянцева, С.С. Бабкина, Г.К, Будников, И.Л. Федорова, H.Н. Ибрагимова, В. Г. Винтер и Г.IO. Бочкарев (53) 549,257 (088.8) (56) Кулис Р.Ю, Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, 1981, с. 177-178.

Авторское свидетельство СССР

N 1296913, кл. G 01 N 27/30, 1987. (54) ФЕРМЕНТНЪ|Й ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии, может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний.

Целью изобретения является расширение аналитических возможностей электрода.

На чертеже представлен график за,висимости высоты катодного пика от концентрации антител.

Образцы полученно" мембраны размерами 25 65 мм помещают на 30 мин при комнатнои температуре в 1ь-ный раствор бычьего сывороточного альбумина в Физиологическом Фосфатном (0,01 M) буферном растворе (ФФБ) с рН 7,0"/,4 для блокирования активных центров глутарового альдегида и

2 (5! ) Изобретение относится к биохимии и иммунологии, и может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний. Целью изобретения является обеспечение возможности определения содержания антител или антигена в анализируемых образцах для диагностики различных заболеваний, в частности алеутской болезни норок. Поставленная цель достигается тем, что в мембрану изаестного ферментного зле троу дополнительно введен антиген или антитела в количестве О, 330,66. мас. >. Чувствительность опреде— лений содержания составляет 5,3 х a х 10 моль/л, время определения 15 мин @

N время жизни мембраны 30 сут. 1 ил. предотвращения неспецифического связывания антител (AT). После промывки боратным буферным раствором с рН 9, 05 пленку закрепляют в гофрированном виде на поверхности корпуса стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой с помощью прижимных колец.

Определение специфических AT основано на электрохимической активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ-бутирилтиохолиниодида (BTXH) C)HgCOSCH — (сн ),.! + и о — с,н,сосн + нзсн—

ХЭ сн„-(сн,) з.

Продукт гидролиза БТХИ тиол способен образовывать меркаптид ртути, 1707522 который восстанавливается на ртутном и амальгамированном серебряном электродах.

На вольтамперограммах БТХИ на стационарном ртутно-пленочном элект45 роде с серебряной подложкой наблюдается небольшой пик при потенциале0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет в присутствии ХЭ. Высота этого пика зависит как от койцентрации субстрата так и от активности ХЭ.

При наличии в исследуемом растворе специфических AT происходит быстрое, благодаря перемешиванию, связывание этих AT с иммобилизованными в нитроцеллюлозной пленке антигенами (АГ) с образованием иммунного комплекса ЯГАТ. Иммобилизованные таким образом иммунокомплексы создают стерические препятствия для подхода молекул субстрата и активным центрам иммобилизованной Х3, что приводит к спаду-высоты пика при потенциале - 0,55 В. Z5 ферментный электрод и электрод сравнения погружают в анализируемый раствор, содержащий буферный боратный раствор с рН 9,05. Раствор термостатируют при 25 С или 37 С, продувают током водорода или аргона и снимают вольтамперогранмы в интервале потенциалов -0,1 - -0,8 В. Минимальный объем анализируемого раствора 4-5 мл, . Титр определяемых AT с использова35 нием предлагаемых ферментных электродов составляет 1:10000.

Предлагаемый ферментный электрод был использован для диагностики алеутской болезни норок.

П р и и е р 1. Построение градуировочного графика для определения концентрации AT B сыворотке крови больных животных.

В мерную колбу на 5 мл вводят

0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,006 г/мл, добавляют от 1 до 100 мкл гаммаглобулиновой

Фракции из сыворотки крови больных норок с концентрацией белка 0,8 мгlмл.

Раствор доводят боратным буфером с рН 9,05 до метки, перемешивают и переносят в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным электродом и фермент ым электродом, содержащим в пленке из нитрата целгюлозы им55 иобилизояанн;: и йГ (к 1f иле рче гкий препарат зверосовхоза "Пушкинский" ) .

Удаляют кислород в течение 15 мин током водорода или аргона и снимают вольтамперограммы в интервале по тенциалов от -0,1 до -0,8 В (скорость наложения потенциала 1 В/с). Измеряют высоту катодного пика при потенциале 0,55 В. Строя градуировочный график, выражающий зависимость высоты катодного пика от концентрации AT.

Далее определяют неизвестную концентрацию специфических антител.

В мерную колбу йа 5 мл вводят

0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 0,006 г/мл, добавляют 3 мкл сыворотки исследуемых животных, доводят до метки боратным буфером с рН 9,05, перемешивают и переносят в ячейку. Все дальнейшие операции проводят, как описано выше.

По высоте пика при потенциале -0,55 В и градуировочному графику определяют концентрацию =пецифических антител:

Диагностику проводят по раэнице .величин пиков при потенциале -0,55 В в отсутствие и в присутствии анализируемой сыворотки животных. Эта разница в величинах-сигналов составляет не менее 2-3 величин стандартного отклонения величины пиков при потенциале -U,55 В в присутствии сыворотки здоровых > ивотных (нулевого стандарте). Стандартное отклонение составляет в наших условиях 0,043 м.

Чувствительность предлагаемого метода составляет 5,3 10 омоль/л специфических антител. Ошибка определения составляет 41, отклик электрода наступает практически мгновенно.

Для многократного использования предлагаемых Ферментных электродов и воэможности автоматизации процесса диагностики заболеваний разработаны условия реактивации пленок из

НЦ с иммобилизованной ХЭ, заингибированной при образовании на поверхности пленок иммунных комплексов.

При выдерживании сенсорной части

Ферментных электродов после измерения исследуемых образцов в Ci 6 М растворе хлорида магния в течение 15 мин пик при -0,55 В достигает исходной величины, что указывает на 1001-ную реактивацию вследствие разрушения комплекса АГ-АТ.

Все результаты определений контролиров;лись методом иммуноферментногo анализа со спектрофотометричес— кой индикацией ферментной активности.

1707522

0,33-0,66 (0,45-0,55) Глутаровый альде гид

Нитрат целлюлозы

Формула изобретения

17,5-18, П

Остальное ферментный электрод для иммуноферментного анализа, включающий корпус, Я,O

<,о

10 з

Составитель И. Рогаль

Техред Л. Сердюкова - Корре кто р M . .Самборс кая

Редактор Н. Лаза ре нко,Заказ 263 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретснилм и открытиям при ГКНТ СССР

113 )35, Москва, !К-35, Раужская наб., д ° 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагари <а,101

Предла гаемые ферментные электроды позволяют селективно (селективность устанавливаю- по отсутствию спада пика при потенциале -0,55 В в присутствии вместо AT норки гаммаглобулинов человека) и с.достаточной чувст— вительностьо (5,3 10 моль/л) проводить диагностику различных заболеваний животных и человека.

<0

Реактивация сенсорной части электродов позволяет испольэовать их многократно, а также для экспресс-диагностики. Время жизни пленки составляе т 30 дней.

f5 внутри которого расположен токосъемник, электролитическн связанный с мембраной, содержащей антитела, о т личающийся тем, что, с целью расширения аналитических возможностей электрода, мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэстеразой, глутаровым альдегидом и антигеном (или антителами) в следующих количествах, мас. :

Холинэстераэа 10,6-12,6

Антиген (или антитела)