Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к соматотропину человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии. Использование моноклональных антител, продуцируемых штаммом № ВСКК(П) 399D, позволяет обеспечить разработку иммунохимических методов детекции соматотропина человека в биологических жидкостях и во фракциях при выделении гормона. Штамм получен путем гибридизации клеток миеломной линии Х.бЗ.Ад 8.653 с клетками селезенки мышей BALB/c, иммунизированных высокоочищенными препаратами соматотропина человека, полученными в ВЭНЦ АМН СССР. В качестве сливающего агента использовали ПЭГ 1500. Селекция клеток проведена на среде HAT, осуществлено два клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки), получено 100% позитивных клонов. Условия выращивания клеток штамма № ВСКК(П) 399D: среда RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, 37°С, газовая фаза-воздух с 5% СОа. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 кл/мл. Тестирование моноклональных антител проводят непрямым иммуноферментным анализом с использованием в качестве антигена высокоочищенного препарата соматотропина человека. После инокуляции клеток в брюшную полость мыши через 10-20 дней получают асцитическую жидкость. С помощью ионообменной хроматографии на колонке ДЁАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют до 6 мг иммуноглобулинов, содержащих около 80-90% моноклинальных антител , продуцируемых клетками штамма № ВСКК(П) 399D. Полученные моноклональные антитела взаимодействуют с соматотропином человека в разведении 1 мкг/мл. С другими гипофизарными гормонами человека и животных, а также с плацентарным лактогеном человека данные моноклональные антитела не реагируют. сл С -ч ю со ю -xj

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (s1)s С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4835631/13 (22) 03.05.90 (46) 30.03.92, Бюл. М 12 (71) Всесоюзный эндокринологический научный центр АМН СССР и Научно-исследовательский институт морфологии человека

АМН СССР (72) А.А.Булатов, Т.А.Осипова, А.Л.Григорьян, P.Ôèäëåð и M,Ш.Вербицкий (53) 578.085.23 (088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СОМАТОТРОПИНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии. Использование моноклональ.ных антител, продуцируемых штаммом hL

В СКК(П) 399D, позволяет обеспечить разработку иммунохимических методов детекции соматотропина человека в биологических жидкостях и во фракциях при выделении гормона. Штамм получен путем гибридизации клеток миеломной линии Х.63,Ag 8.653 с клетками селезенки мышей BALB/с, иммунизированных высокоочищенными препаратами соматотропина человека, полученными в ВЭНЦ АМН СССР. В качестве сливающего агента использовали ПЭ Г 1500.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для детекции соматотропина человека .иммунохимическими методами в биологических жидкостях и тканях, а также во фракциях

Селекция клеток проведена на среде НАТ, осуществлено два клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки), получено 100% позитивных клонов.

Условия выращивания клеток штамма М

ВСКК(П) 399D: среда RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, 37 С, газовая фаза — воздух с 5% СО2.

Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза

500000 кл/мл. Тестирование моноклональных антител проводят непрямым иммуноферментным анализом с использованием в качестве антигена высокоочищенного препарата соматотропина человека. После инокуляции клеток в брюшную полость мыши через 10 — 20 дней получают асцитическую жидкость. С помощью ионообменной хроматографии на колонке ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют до 6 мг иммуноглобулинов, содержащих около 80 — 90% моноклональных антител, продуцируемых клетками штамма 1Ф

ВСКК(П) 399D, Полученные моноклональВ ные антитела взаимодействуют с соматотропином человека в разведении 1 мкг/мл. С другими гипофизарными гормонами челове- 3 ка и животных, а также с плацентарным лак- () тогеном человека данные моноклональные а антитела не реагируют. ЬЭ при выделении гормона. На основе этих моноклональных антител могут быть созданы иммуносорбенты для выделения гормона.

Известны моноклональные антитела к соматотропину человека.

1723127

Некоторые.из известных моноклональных антител имеют перекрестную реакцию с родственными антигенами, другие специфичны для соматотропина человека, Цель изобретения состоит в получении штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к соматотропину человека, не дающие перекрестных реакций с другими гипофизарными гормонами человека и живртных и с плацентарным лактогеном человека.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена используют высокоочищенный соматотропин (СТ) человека, полученный в ВЭНЦ АМН СССР. Мышей линии BaLB/с иммунизируют высокоочищенными препаратами СТГ человека по следующей схеме; в 1-й день 100 мкг гормона в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), на

28-й и 46-й дни по 50 мкг гормона в ПАФ.

Реиммунизация на 56-й день — 100 мкг гормона в фосфатном буфере (ФБ). Через три дня после реиммунизации у мышей стерильно берут селезенку и готовят суспензию спленоцитов. Гибридомы получают путем слияния спленоцитов с клетками мышиной миеломы Х.63.Ag.653 с помощью 50% полиэтиленгликоля с М.м, 1500, Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. Селекцию проводят на среде НАТ, выполняют два клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки), получают

100% позитивных клонов. Стандартные условия выращивания; среда RPMI-1640 с

10%-ной фетальной сывороткой крупного рогатого скота, температура при культивировании 37, газовая фаза — воздух с 57

СО2.

Способ культивирования — в пластиковых флаконах на 50 — 250 мл, кратность посева 1:2, время субкультивирования 3 — 4 дня.

Рабочее разведение моноклональных антител против соматотропина человека в культуральной среде 1:500 — 5000 в ИФА (иммуноферментный анализ). B организме животного — мышь BaLB/с, обработанная пристаном (1 мл в/бр за 5 дней до инокуляции), доза инокуляции 3 — 8 10, время образования асцита 10 — 20 дней.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен Ф 17. Штамм хранится в Специализированно коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 399D и характеризуется следующими признаками. Данные выдовой принадлежности: мышиные клетки BaLB/ñ, Гибридома секретирует моноклональные антитела, определяемые иммуноферментным методом. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены.

Штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела 61 класса, на5 правленные к соматотропину человека, специфичность оценивается иммуноферментным методом. Моноклональные антитела не реагируют с плацентарным лактогеном человека, пролактином человека и с со10 матотропином и пролактином быка, Концентрация моноклональных антител в культуральной среде около 10 мкгlмл, в асцитной жидкости около 7 мг/мл, титр антител в асцитической жидкости 2 . 10 — 10 при

5 7

15 концентрации антигена при нанесении на плейты 1 мкг/мл. Продукция моноклональных антител стабильна по крайней мере в течение 30 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается

20 на мышах.

Способ крио консервации: 4 х 10 клеток в RPMI-1640 с 10% FCS+ 10%DMSO, замораживание в пенопластовой коробке при—

70 С. Жизнеспособность клеток после

25 размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности клеток по исключению трипанового синего после 24 ч культивирования).

Определение специфичности монокло нальных антител Ф 17, 30 Моноклональные антитела против соматотропина человека получены путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Из 1 мл асцита с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ

35 целлюлозой выделено 6,8 мг антител к соматотропину человека. Для проверки специфичности моноклональных антител Ф 17 была исследована их способность связывать гомологичный антиген человека, пол40 ученный генноинженерным способом, а также соматотропин быка, плацентарный лактоген и пролактин человека, пролактин быка и пролактин свиньи. Моноклональные антитела реагировали только с соматотро45 пином человека и не реагировали с плацентарным лактогеном и пролактином человека, с соматотропином быка, пролактином быка и свиньи, Пример 1. Использование монАТ Ф

50 17 в качестве высокоспецифического детектора при определении соматотропина человека с помощью ИФА, На микротитровальных плейтах сорбируют аффинно очищенные поликлональные

55 антитела к соматотропину человека (в концентрации 20 мкг/мл). Затем в лунки вносят по 60л I стандарта соматотропина человека в фосфатном буфере в известной концентрации. После инкубации 1 ч в лунки добавляют по 60/„ I конъюгата монАТ Ф 17 с

1723127

Формула изобретения

30

40

Составитель А.Булатов

Техред М.Моргентал Корректор О.Кундрик

Редактор Н.Горват

Заказ 1042 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-,35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 пероксидазой хрена в 0,1 -ном растворе

BSA. Плейты инкубируют 40 мин и добавляют субстрат для развития ферментативной реакции (о-фенилендиамин в Na-цитрат фосфатном буфере, содержащем 0,012oj перекиси водорода). Инкубируют 30 мин при

37 С. Останавливают ферментативную реакцию, добавляя в лунки 10, серную кислоту. Интенсивность окраски в лунках измеряют с помощью спектрофотометра с вертикальным лучем 492 нм. По полученным значениям оптической плотности были построены калибровочные кривые. Данные моноклональные антитела могут быть использованы в качестве специфического детектора при создании иммуноферментной тест-системы для определения соматотропина человека.

Пример 2. Радиоиммуноблотинг соматотропина человека с использованием монАТ серии Ф 17.

Продуцируемые штаммом Ф 17 монАТ к соматотропину человека использованы для идентификации соматотропина человека в системе иммуноботинга. С этой целью по окончании обычного электрофореза соматотропина человека в ПАГ в присутствии

5 додецилсульфата натрия проводят перенос антигена с геля на нитроцеллюлозу в течение 8ч при 4 С. Затем втечение 6ч при37 С следует забивка свободных от антигенаа мест на нитроцеллюлозе раствором 5$-но10 го овальбумина в фосфатном буфере, содержащем 0,05 твин-20. После этого нитроцеллюлозу в течение 24 ч при 4 С обрабатывают меченными 1 монАТ. МонАТ

Ф 17, меченные 1 обнаруживали соматот15 ропин человека на нитроцеллюлозе.при внесении его в гель в количестве 10 мкг.

20 Штамм гибридных культивируемых кле. ток животных Mus musculus L. ВСКК(П)

399D-продуцент моноклональных антител к соматотропину человека.