Способ определения патогенности искусственных комбикормов для карповых рыб

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в рыбоводстве для определения патогенности искусственных комбикормов. Целью изо бретения является повышение точности определения . В корме, содержащем менее 500 клеток гриба Candida guHlermondfl на 1 г определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью. Патогенным считают корм в случае наличия в 1 г корма более 5% от общего количества клеток гриба, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью. 2 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ . РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 г

ОПИСДНИЕ ИЗОЬРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4703225/13 (22) 09.06.89 (46) 30.04.92. Бюл. №1.6 . (71) Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (72) Н.В.Войнова и M.B.Áeðìàíò (53) 639;36 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 389446, кл. 6 01 и 21/00, 1973.

Авторское свидетельство СССР № 895394; кл. А 23 K 1/14; 1981.

Авторское свидетельство ЧССР

¹ 228040, кл. А 23 К 1/00, 1984.

"Изобретения в СССР и за рубежом", bh

5.

Пономарев Л.В., Рыжикова Л.С. и др.

Контроль и оценка качества кормов для рыб.

Рыбное хозяйство. 1985, № 6, с.43 — 44.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в комбикормовой промышленности и рыбоводстве для определения патогенности искусственных . комбикормов.

Известны гостированные способы контроля санитарного состояния комбикормов (1, 2 и 3), которые однако не предусматривают контроль за количеством грибной микро-. флоры в корме, а также имеют низкую степень достоверности, так как основаны:на органолептических показателях.

Наиболее близким к предлагаемому является. способ контроля и оценки качества. кормов для рыб. Указанный способ предусматривает определение видового состава грибной микрофлоры корма, в т.ч, грибов рода Candida и сравнение полученных дан,, Ы,„, 1729346 А1 (si)s А 01 К 61/00, А 23 К 1/00

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ ИСКУССТВЕННЫХ КОМБИКОРМОВ ДЛЯ КАРПОВЫХ РЫБ (57) Изобретение относится к микробиологии и Мо-кет быть использовано в рыбоводстве для определения патогенности искусственных комбикормов. Целью изо" бретения является повышение точности определения. В корме, содержащем менее 500 клеток гриба Candlda 9ийегаопбИ íà I r определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью.

Патогенным считают корм в случае наличия в 1 г корма более 5 от общего количества клеток гриба, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью. 2 табл. емеЪ ных с предельно допустимой нормой их содержания в 1 г корма, которая составляет

500 клеток..

Как показали исследования, одной из О доминирующих культур микрофлоры в ком- . (д бикормах для карповых рыб являются гри- ф, бы. О

Указанные грибы являются условно-патогенной микрофлорой и содергкетсл е on- )клг ределенном. количестве во всех комбикормах, проявляя свою патогенность либо изначально, либо при увеличении их содержания в корме сверх допустимого количества, что в свою очередь связано с нарушением технолдгии производства кормов и условий их хранения. В связи с этим объективно необходимо контроль за санитарным состоянием кормов.

1729346 хность среды пипеткой 3 мл 1 н, раствора соляной кислоты, которая осаждает только

Однако контроль санитарного состояния искусственных комбикормов для карповых рыб путем учета только количественного содержания данного рода грибов в корме явно недостаточен.

Так, установлено, что внутри только одного вида Candlda gulllerrnondil, входящих в род грибов Candida, имеются как патогенные, так и непатогенные грибы. При ежедневном пероральном введении рыбам в одном варианте патогенных и в другом варианте непатогенных грибов в равных количествах (400 кг/л) при идентичных условиях содержания в первом случае через 10 сут, произошла 100%-ная гибель рыб, во втором случае гибели рыб не было.

Указа. нные фэ кторы подтверждают, что только количественная характеристика грибов вида С.guliliern!ondii в корме не позволяет дать всесторонню о достоверную оценку санитарног0 состояния корма, особенно в тех случаях, когда их количество в корме менее установленной нормы, Цель изобретения — повышение точности определения патогенности искусственных кормов, Для достижения поставленной цели готовят нэвеску исследуемого корма, например, 10 г, помещают в колбу и добавляют 90 мл от< .рильного ф>изиологического раствора, получая разведение 1 10.

После вэбэлтывэния колбы на шуттельэппарэ;а в течен::е 15 — 20 мнн стерильной пипсткоР отбирэ юг 1 мл взвеси и переносят в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора, получал разведение 1:100.

Разведение 1:1000, 1:10000 получали аналогичным образом, Иэ полученных разведений делают высевы в чашки Петри со средней Сабура в количестве 1 мл. Посевы инкубируют в термостате при 27 С в течение 48 — 72 ч, после чего производят количественный учет выделенных грибов и сравнивают полученные данные с предельно допустимой нормой .их содержания 500 клеток/г.

В случае превышения указанной предельно допустимой нормы, корм считают непригодным для скармливания рыбам, При содержании грибов вида

С,guililermondil в 1 r корма менее допустимой нормы, т.е. менее 500 кл/г дополнительно определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью.

Для этого грибы высевают на ДНКазный агар в чашки Петри, которую затем помещают в термостат и инкубируют втечение полимерную дезоксирибонуклеиновую кислоту агара, в результате чего последний приобретает матовую окраску

Дезоксирибонуклеиновая кислота, деполимеризованная деэоксирибонуклеазой грибов, не осаждается соляной кислотой, в результате чего вокруг колонии грибов образуется прозрачная эона деполимеризации, диаметр которой измеряют и. при полученных значениях диаметра зоны деполимериэации 2 мм и более культуру грибов считают обладающей деэоксирибонуклеаэной активностью патогенной.

Затем определяют количество патогенных грибов в навеске, Если это количество составляет более 5% от общего количества клеток, гриба, корм считают патогенным и непригодным для использования, Пример 1. Из партии искусственного корма для карповых рыб марки ПКВР выделяли в соответствии с "Методами исследо20 вания в ветеринарной микологии" грибы вида С.gullliermondii и определяли их количество в 1 r корма. Оно составило 0,5

Tblc,êëåTîê, т.е, корм в соответствии с известным способом пригоден для скармливания рыбам. Полученные колонии грибов помещали на ДН Казный агар в чашки Петри и инкубировали в течение суток в термостате при +27 С.

Гlо истечении укаэанного срока чашку

Петри вносили 3 мл 1 н. раствора НС и определяли зону деполимеризации нэ

ДНКазном эгаре. Она составила 0,7 мм, т.е деэоксирибонуклеаэная активность отсутствует. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что указанные грибы непэтогенНы.

Для подтверждения данного вывода указанную партию корма испольэовали при кормлении карпов в бассейне, Количество рыб в бассейне 20 шт„средний вес 150 г.

Гидрологические условия содержания соответствовали норме, По истечении 10,20 и 30 сут кормления исследовали состояние внутренних органов рыб. Отклонений от нормы не выявлено, На основании оценки результатов исс35

40 ледования патогенности грибов и влияния

45 их количественного содержания нэ состояние внутренних органов рыб был сделан окончательный вывод о пригодности данной партии корма для скармливэния, Пример 2. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру из

50 другой партии корма, выделены грибы того

1 сут при 4+ 27ОС; Через сутки инкубации же вида в количестве 0,6 тыс,клеток в 1 г чашку Петри извлекаат и наносят на повер- корма, Под воздействием этих грибов на

1729346

20 ду 30 сут

45

55

ДНКазный агар зона деполимеризации вокруг колоний составила также 0,7 мм, на основании чего был сделан вывод об их непатогенности.

Данный корм скармливали в течение 30 сут карпам в условиях, аналогичных предшествующему примеру.

Патолого-анатомические исследования внутренних органов на этапах 10 — 20 сут не показали отклонений от нормы. На этапе 30 сут была выявлена анемия жабер, почек и печени, на основании чего был сделан вывод, что причина проявления патогенных свойств грибов, которые изначально были непатогенны — их количественное содержание в 1 rкорма 0,,6 тыс.клеток, или на 20% больше, чем в предыдущем примере т.е. результаты данного опыта еще раз подтвердили правильность установленной в прототипе предельно допустимой нормы содержания грибов данного вида в 1 г корма.

Пример 3. В условиях эксперимента, аналогичных примеру 1 количество грибов 1 корма составляло 0,4 тыс.клеток. Зона депо- лимеризации ДКНазного агара вокруг коло-. ний грибов составила 2,4 мм.

После скармливания корма в течение 10 и 20 сут карпам-годовикам патолого-анатомические исследования не выявили отклонений внутренних органов от нормы.

По истечении 30 сут была выявлена анемия жабер, почек и печени, т.е. в данном случае причина указанных явлений заключается в изначальной патогенности самих грибов, так как количественное содержание их в 1 r корма менее установленной предельно допустимой нормы.

Пример 4. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру, зона деполимеризации ДНКазного агара вокруг колоний грибов составила 2,5 мм, В данном случае анемия внутренних органов проявилась уже на 20 сут скармливания корма. т,е. при одинаковом с предшествующим примером количестве грибов в 1 г корма решающее влияние на патогенез у рыб оказывает изначальная па. тогенность грибов.

Результаты экспериментов отражены в табл.1.

Во второй серии экспериментов устанавливали количество патогенных грибов в навеске; которое может негативно влиять на физиологическое состояние рыб.

Пример 5. Двадцати рыбам перорально вводили суспензию, содержавшую 400+

7 клеток грибов С.guiiliermondii, т.е. менее предельно допустимой нормы (500 кл/л), среди которых 5% составляли грибы. обладавшие активностью дезоксирибонуклеазы, т.е. патогенные (зона деполимеризации

ДНКазного агара грибами составляла 2,4 мм), .

Суспензию вводили рыбам в течение 30 сут и результаты оценивали по физиологическому состоянию рыб, У данной группы рыб в течение всего эксперимента не наблюдалось достоверных отклонений от нормы по поведенческим реакциям и в весе, гибели рыб не было, т.е. данное количество грибов в корме, несмотря на патогенность, не оказывает достоверно негативного влияния на организм рыб, очевидно, не подавляя его резистентность.

Пример 6, В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру, количество патогенных грибов составляло

7%. У рыб данной группы после 20 сут опыта наблюдалось угнетение реактивной способности и достоверное снижение веса к исхоГибели рыб не наблюдалось.

Пример 7. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующим примерам, количество патогенных грибов в суспензии

25, увеличили до 10 %, В результате на 30 сут опыта наступила гибель 10% рыб.

Пример 8 и 9. B условиях экспериментов, аналогичных предшествующим примерам, количество патогенных грибов в суспензии увеличивали до 20 и 30%. Гибель рыб составила 35 60% соответственно.

Результаты этой серии экспериментов сведены в табл,2. Зависимость физиологического состояния рыб от содержания патогенных грибов вида С.цц!!!!еггпопб!! в предельно допустимой норме их общего количественного содержания в 1 г корма.

Из данных табл,2 очевидно, что если в 1 г корма содержится грибов вида

С.guilliermondii менее 500 клеток, среди которых более 5% составляют патогенные грибы, т.е.. обладающие активностью дезоксирибонуклеазы, такой корм патогенен и непригоден для использования. Скармливание его рыбам приводит к последовательному угнетению поведенческих реакций, снижению веса рыб и к коматозному состоянию и гибели.

Формула изобретения

Способ определения патогенности искусственных комбикормов для карповых рыб, предусматривающий приготовление навески исследуемого корма; равной 1 г, последующее определение в ней количества клеток гриба Candida guillermondii и отнесение исследуемого корма к патогенным в случае наличия более 500 клеток гриба в навеске, отличающийся тем, что, с

1729346

Таблица1 целью повышения точности определения, в корме, содержащем менее 500 клеток гриба на 1 r, дополнительно определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонулеазной активностью и патогенным считают исследуемый корм в случае наличия в навеске более 5ф от общего количества клеток гриба, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью.

1729346

Ф m

X m

Е х о

Р

C)

СЧ х

r и

С>

1 1 I и

С7

С Ъ и

С)

СЧ

С>

C) и

СО

C)

СЧ

Ф

X. о

1v о и

Ф

S х

Ф о Ф

r л! Ф ее х

grPo

0 о

Р и

С)

С ) S

I о оиФ

1"

I-0S

mur о е

X о х

Х

a. -=

О

Р

C)

СЧ

1 и

g s> o s X саИо а в и х х щ х

X S ос >

Щ О@2

m m

6) о

am

Ф C f, e о s

Q r х <

2 а р

x o

Ф S

Х!01

0 O

I х

Ф

3( и о

С и

Л о

3Е

Ю

Б о. с

Ф !

О

S !

Ф «Г

Р (p

О м и о g

Ф gp о

С: с о о Е

à0

Ф О m.вО с !0 ct

Q. )

l о о

О L0 оо о о

СЧ СЧ оо о о

СЧ СЧ СЧ СЧ х а* ° х

О!

Х т I I и в Ф

СЧ 1 I 1 оо о

° СЧ С Ъ