Способ выделения ингибитора ангиотензин-1-превращающего фермента из яда животного происхождения

 

Использование: биохимия, получение биологически активных веществ. Сущность изобретения: способ получения белка-ингибитора а нгиотензин-1-превращающего фермента заключается в выделении цельного яда из экстракта гомогената ядовитой железы паука Latrodectus tredecimgutlatus, фракционировании его на гидрофильном геле поперечносшитого декстрана для отделения низкомолекулярной фракции с мол. массой 5-10 кДа, дальнейшем разделении полученной фракции на ДЕАЕ-сефадексе при рН 8 в линейном градиенте концентрации NaCI, последующей очистке ее на колонке с гелем Ультропак С-2000 при умеренном давлении в 0,5.%-ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5, определении ингибирующей активности в полученных фракциях, отборе активной фракции и ее сушке. Получают белок-ингибитор, содержащий 94 аминокислотных остатка с мол. массой ЮкДа, изоэлектрическойточкой Р0 4,7 с N-концевым остатком - гтгутаминовой кислотой и ICso , равной IxlO M, и константой ингибирования KI, равной М. Высокая активность белка создает предпосылки для использования его в качестве терапевтического средства антигипертензивной направленности. 11 ил. СО С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 07 К 3/12, 7/10, 7/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ 4 (л)

О

О

QO (21) 4797410/13 (22) 05.03.90 (46) 30.04.92. Бюл. N 16 (71) Институт биоорганической химии АН

УЗССР (72) Н. А. Соснина, 3. Голубенко и А. А. Ахунов (53) 57.042,2(088.8) (56) Aiguel A„0ngetti N. I„Emily F, S.

AngIotensin-converting Engyme inhibitors

from the venom of Botrops jararaca. Isolation, E!ucidatlon of Structure and Synthesis,—

Biochemistry, 1977, v. 19, ¹ 22, р. 300. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРА

АН ГИОТЕ Н 3 ИН-1-П PE В РАЩАЮ ЩЕГО

ФЕРМЕНТА ИЗ ЯДА ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (57) Использование: биохимия, получение биологически активных веществ. Сущность изобретения: способ получения белка-ингибитора ангиотензин-1-превращающего фермента заключается в выделении цельного яда из экстракта гомогената ядовитой

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения биологически активного белка, который может быть использован в медицине как потенциальнотерапевтическое средство антигепертензивной направленности.

Известны пептиды с ингибирующей ак- тивностью к АПФ, выделенные из яда змеи

Bothrops jararaca;

Способ выделения представлен на схеме (фиг. 1). Как видно из схемы, выделение пептидов из яда змеи Bothrops jararaca npo„„ Ы„„1730088 А1 железы паука Latrodectus tredecimgutlatus, фракционировании его на гидрофильном геле поперечносшитого декстрана для отделения низкомолекулярной фракции с мол. массой 5 — 10 кДа, дальнейшем разделении полученной фракции на ДЕАЕ-сефадексе при рН 8 в линейном градиенте концентрации NaCI, последующей очистке ее на колонке с гелем Ультропак С-2000 при умеренном давлении в 0,5.%-ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5, определении ингибирующей активности в полученных фракциях, отборе активной фракции и ее сушке. Получают белок-ингибитор, содержащий 94 аминокислотных остатка с мол. массой 10кДа, изоэлектрической точкой Рр

4,7 с N-концевым остатком — глутаминовой кислотой и! СБо, равной 1х10 M, и константой ингибирования Кь равной 5х10 " М. Высокая активность белка создает предпосылки для использования его в качестве терапевтического средства антигипертензивной направленности. 11 ил. ! водится поэтапно путем гель-фильтрации цельного яда на сефадексе G-25 (элюант—

0,2 М уксусная кислота), полученную активную фракцию подвергают ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе ОИ-52,. причем элюцию проводят ступенчато от

0,005 до 0,.2 М аммонийацетатным буфером, после получения двух фракций, первую, обладающую ингибирующей активностью, делят на ионообменнике — ДЕАЕ-сефадексе, элюируя аммонийбикарбонатным буфером при линейном градиенте от 0,005 до 1М, 1730088 затем отбирают одну из полученных 10 фракций, обладающую ярко выраженной ингибирующей АПФ-активностью, и подвергают ее гель-фильтрации на сефадексе

G-25 в этилацетатном буфере; для выделения наиболее активного и гомогенного пептида используют электрофорез на бумаге.

Полученный пептид-ингибитор характеризуется ICso, равным 0,3 мкг/мл.

Как видно из приведенной схемы (фиг. 1), способ выделения этого пептида трудоемок, необходимо приготовление разнообразных буферных растворов, при этом полученный пептид обладает низкой активностью.

Цель изобретения — повышение ингибирующей активности, Цель достигается получением белка-ингибитора фермента АПФ, содержащего 94 аминокислотных остатка, с мол. массой

10 кДа, изоэлектрической точкой Р; 4,7 с

N-концевым остатком — глутаминовой кислотой путем выделения цельного яда из экстракта гомогената ядовитой железы паука

Latrodectus tredecimguttatus фракционированием его на гидрофильном геле TSK — HW55 для отделения низкомолекулярной фракции

c Mr 5-10 кДа, дальнейшего разделения полученной фракции на TSK-ДЕАЕ при рН 8 в линейном градиенте концентрации NaCI, последующей очистки ее на колонке

Ultropac G-2000 при умеренном давлении в

0,5 -ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5 (схема на фиг, 2), определения ингибирующей активности в полученных фракциях и отбора активной фракции.

Сопоставительный анализ полученного белка-ингибитора АПФ с известными позволяет сделать вывод, что белок,. выделенный из яда паука L, tredecimguttatus обладает высокой константой ингибирования, а также отличается приемами и режимами выделения его из яда.

На фиг. 3 показана хроматограмма разделения яда паука Latrodectus

tredecimguttatus íà TSK-HW-55; на фиг. 4— хроматограмма разделения активной фракции на TSK-ДЕАЕ; на фиг, 5 — хроматограмма на колонке Ultropac G-2000 при умеренном давлении в 0,5 -ном ацетонитрилфторацетатном буфере, рН 6,5.

Пример 1. а) Приготовление природного сырья.

Цельный яд получают от взрослых самок пауков (5000 особей) и репарацией хелицер и последующей их гомогенизацией при

0-4 С. Гомогенат центрифугируют при

20000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отделяют и лиофилизируют. Лиофильо но высушенный яд хранят при 0 С. б) Выделение активной фракции.

500 мг сухого яда растворяют в 5 мл трис-НС!-буфере, рН 8,0, 0,05 M наносят на колонку с гидрофильным гелем TSK-НИ/-55.

Сорбцию проводят в 0,05 М трис-HCI-буфе5 ре, рН 8,0, элюируя тем же буфером. Получено 6 фракций. Детекцию проводят при длине волны 280 нм (фиг. 3), Каждую из шести фракций исследовали на ингибиторную активность. Из фиг, 3 видно. что получе10 но 6 фракций.

Фракции I u ll представляют собой высокомолекулярные белки, фракции II! и Иполипептиды с мол. массой 5 — 10 кДа, фракция I!I проявляла высокую ингибитор15 ную активность, фракции V и И вЂ” вещества непептидной природы.

Фракцию III собирают и лиофильно высушивают. Выход 150 мг, Фракцию III подвергают дополнитель20 ной очистке: для этого 150 мг фракции III растворяют в 2 мл трис-HCI-буфера, 0,05 М, рН 8,0, и наносят на колонку с TSK-ДЕАЕ, уравновешенной 0,05 М трис-H Cl-буфером, рН 8,0, в градиенте концентрации NaCI

25 0,05 — 0,2 М. Скорость элюции 33 мл/ч (фиг. 4). Из фиг. 4 видно, что фракция Ill делится в этих условиях еще на 3 фракции, Отбирают только фракцию III-2, проявляющую высокую ингибиторную активность.

Выход 90 мг. Затем фракцию III-2 наносят

30 на колонку (7,5х600 мм) Ultropac 6-2000 и проводят разделение при умеренном давлении, используя в качестве элюанта 0,5%ный ацетонитрилфторацетатный буфер. рН

6,5 (фиг. 5). Гомогенность полученного белка

35 иллюстрируется фиг, 5, где показано, что эта фракция элюируется с колонки в виде одного симметричного пика, Выход 40 мг, Полученный ингибитор АПФ после высушивания представляет собой белое

40 хлопьевидное вещество, хорошо растворимое в воде. . в) Доказательство гомогенности ин ибитора АПФ, Гомогенность ингибитора, выделенного

45 из яда паука Latrodectus tredecimguttatus, доказана электрофорезом в градиенте ПААГ

10 — 24 с 0,1 ИДЯ, Мол. масса, определенная этим методом, составляет 10 кДа. Изоэлектрическая точка находится в кислой

50 области (Р; 4,7). Аминокислотный состав белка установлен по результатам 24-, 48-, 72-часовых гидролизатов; Ингибитор состоит из 94 аминокислотных остатков с и реимущественным содержанием гистидина, 55 глутаминовой кислоты, глицина, На N-конце обнаружена глутаминовая кислота. Наличие в структуре сульфидных связей обеспечивает стабильность ингибитора к нагреванию в кислой среде, 1730088

45 твором флурескомина в ацетоне, 50

Полученные данные (фиг. 7) показывают, что полипептид, выделенный из яда паука

Latrodectus tredecimguttatus. ингибирует

АПФ, так как в брадикинине не расщепляется связь Про — Фен, которая специфична

7 8 для АПФ, Это также свидетельствует о том, что полипептид, выделенный из яда паука, полностью ингибирует активность АПФ, г) Определение ингибиторной активности проводят двумя методами.

Флуориметрический метод, Для этого 0,1 мкг АПФ предварительно инкубируют в 1,9 мл 0,005 M мединалового буфера, рН 7,4, с белком из яда паука в течение 20 мин при 37 С, а затем добавляют

0,1 мл 1 мМ раствора-субстрата (кбз-фенгис-лей) с последующей флюорометрией.

Для этого к пробам (стандартным и исследуемым) добавляют по 0,4 мл 2 M раствора

NaOH и 0,1 мл 1%-ного раствора о-фталевого диальдегида, Через 6 мин после добавления диальдегида к пробам приливают по 0,2 мл 6 н, раствора HCI, Интенсивность флюоресценции замеряют на флюорометре фирмы "Opton".

Ингибирующее действие анализируемого белка на АПФ оценивают по снижению (%) активности фермента соответствующей концентрации ингибитора, Полученные величины наносят на графики и вычисляют величину !Со, которая равна 1х10 M. Константа ингибирования К=5х10 М (фиг.6)

-Q

Методом тонкослойной хроматографии на силикагеле препарат фермента (1,5 Е) предынкубируют при 37"С в 0,1 мл 0,02 M

Иа-фосфатного буфера, рН 8 содержащего

30 мкг ингиЬитора из яда, в течение 30 мин.

Затем прибавляют 0,1 мл раствора БК (30 мкг) в том же буфере и продолжают инкубацию еще 20 мин, Реакцию прекоащают подкислением до рН 2 (0,01 мл 1 í. HCi), В качестве "свидетеля" ферментативный гидролизат брадикинина получают следующим образом; БК(30 мкг) инкубируют 20 мин при

37 С с АПФ (1,5 мЕ) в 0,2 мл 0,02 M Na-фосфатного буфера, рН 8, Реакцию останавли вают 0,01 мл 1 í, HCI до рН 2. Аликвоты гидролизатов наносят на пластинки

10х10 см с тонким слоем силикагеля

KiesilgeI — 60 ("Mегоk") параллельно с контрольными приборами и пептидами-"свиде-. телями". Хроматографию ферментативных гидролизатов проводят в системе растворителей н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3). Положение пятен на хроматограммах выявляют в УФ-свете после опрыскивания пластин 0,02%-ным рас5

Исследование выделенного белка показывает, что 0Н является новым соединением, проявляющим на порядок выше ингибиторную активность, чем пептид, выделенный из яда змеи.

П р и и е р 2. Аналогичен примеру 1б, за исключением того, что для фракционирования цельного яда используют колонку с гел ь-сефадексом G-50 (фиг. 8).

Пример 3, Аналогичен примеру 1б, за исключением того, что фракционирование ведут 0,05 M в трис;НС!-буфере, рН 7 (фиг, 9), Пример 4. Аналогичен примеру 1б, за исключением того, что фракционирование ведут при рН 6,5 (фиг. 10).

Пример 5. Аналогичен примеру 1б, за исключением того, что фракционирование ведут при рН 8,5 (фиг. 11), Как видно из фиг. 8, разделение низкомолекулярных фракций на гель-сефадексе

G-50 происходит недостаточно эффективно.

Из фиг, 5-9 видно. что наиболее оптимальное разделение достигается при рН 78.

Таким образом, изобретение дает возможность получить высокоактивный и устойчивый белок-ингибитор АПФ, который, может быть использован в качестве средства для регуляции активности ренин-ангиотензивнсй, а также калликреин-кининовой системы а организме.

Формула изобретения

Способ выделения ингибитора ангиотензин-1-превращающего фермента из яда животного происхождения, предусматривающий фракционирование его на хроматографических колонках, отличающийся тем, что, с целью повышения ингибирующей активности, используют -яд паука

Latrodectus tredecimgunatus, фракционирование проводят на колонке с поперечносшитым декстраном с размером частиц

30-60 а м и разрешающей способностью по белку 1000-600000 в 0,05 трис-HCI буфере, рН 8, отбирают активную фракцию и хроматографируют ее на колонке с диэтиламиноэтилсефадексом с размером частиц

44 — 88 р м, уравновешенной 0,05 М трис-H CI буфером. рН 8 в градиенте концентрации

NaCi 0,05-0.2 IVl, затем подвергают гельфильтрации на колонке с гелем Ультропак

G-2000 с размером частиц 10 2 р м и разрешающей способностью по белку 500-6000Г и активную фракцию высушивают, 1730088

1 сирия бедадгкс G -25 юлаза 2 стадия — сефадекс 3 cmobs up

И И D X IZ Xl Z

Ф и адия

Сеаодекс G -Л5

kfeeufumop АЛФ

Фиг.1

5-стадию фиг.2 (д (2) ДГ) (б) (7) (Е (У3 Я.) б мвжная «роматгрпфия Х cmadug илоарация нц TJK-нй-55

f-стИия иенная роиаапграрщ на

Я- Фи

mozpupus нп к ланке

tzo 0ас 6-2000 Л4

1730088

1730088

1730088

280

2,0

?,О

Ôö2.9 .П

<)V

20 20

1730088

50 о0

Ноиера пробирок

1730088

280

2,0 1,0

10 20 30 gg 50 GO 70

g< g Ноиера пробирок

7,5

7,0

0,5

Составитель О. Скородумова

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Д, Сычева

Редактор А. Огар

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1486 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5