Способ получения авидина

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„, 16435

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4691749/04 (22) 15.05.89 (46). 23.04.91. Бюл. Ф 15 (71) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардт а, Научно-произ водственное объединение "Биолар" АН СССР и МГУ им. М,В,Ломоносова (72) И.К.Залите, Э.А.Аренс, А. М. Шу стер, А, Г. Габиб ов, А. Г. P абинко в и В.И. Березин (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Grun N.М., Tomas Е.I. Furitication апй crystallization of avidinBiochem, I 1970, 118, с. 67-70. (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИДИНА (57) Изобретение касается гликопротеидов, в частности получения авидина (тетрамера гликопротеида с мол .м. 67000), применяемого в медициИзобретение относится к способу получения авидина - биологически активного соединения, который находит применение в медицине, химической, микробиологической и пищевой промышленно сти.

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение выхода.

Пример 1. Все операции, кроме осаждения органическим растворителем, проводят при комнатной температуре (18-25 С), На стадии фрикциони рования сульфатом аммония к 50 л свежего яичного белка добавляют 20 л денонизированной воды (соотношение 5:2), гомогенизируют и к раствору при пере(51)5 С 07 К 3/02 3/28//А 61 К 37/02

2 не, Цель - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса..

Последний ведут гомогенизацией яичного белка с последующими осаждением гомогенизата с помощью сульфата аммония в диапазоне концентраций 40-1003 насыщения, растворением осадка в воде, повторным осаждением с помощью полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40757, экстракцией из осадка авидина кислым буферным раствором при рН 16 хроматографированием экстракта на колонке с КИ-целлюлозой, элюированием, диализом и выделением целевого авидина. Выход 94Х, удельная активность 15,4 ед/мг, электрофоретическая чистота 99,37 ° Эти условия сокращают стадийность процесса с 10 до 5, 2 табл. С

Ю мешивании постепенно добавляют 30 Kr сульфата аммония (657 насыщения) и перемешивают до полного его растворения.,©

Осадок отделяют центрифугированием : Q (1200д, 20 мин) и отбрасывают, К Q

56 л супернатанта при перемешивании ф постепенно добавляют сульфат аммония до полного насыщения раствора (около 10 кг). Осадок собирают иентрифугированием, супер нат ант отбр асывают.,В

На стадии осаждения полярным органическим растворителем осадок, содержащий авидин, растворяют в деионизированной воде и разбавляют до оптической плотности раствора

10 15 опт.ед/млн при 280 нм, Раствор

1643554 белка перед добавпением оаствовителя охлаждается до температуры от -2 до

-4 С (смесь сухого льда с ацетоном или смесь льда с поваренной солью).

Органический растворитель добавляют охпажденным до температуры -30 до

-50О С (низкотемпературный холодильник или жидкий азот, или смесь сухого льда с ацетоном) при перемешивании небольшими порциями. Температура смеси пбдцерживается в пределах 210 С.

К 4 л охлажденного раствора белка добавляют 6 л этилового спирта. После добавления всего количества спирта перемешивание продолжают 10-15 мин, после чего суспензию центрифугируют (1200g 20 мин ), На стадии экстракции авидина из осадка после центрифугирования осадок объединяют и суспендируют с помощью гомогенизатора в 600 мп буфера

0,1 M глицин/HCl, рН 2,0 и перемешивают в теченйе 30 мин. Супернатант отделяют центрифугированием (1200д, 20 мин), осадок экстрагируют еще в

500 мп того же буфера, Осветленные экстракты объединяют. рН раствора доводят до 6,8 (конц, NH40H)

На стадии хроматографии на KMцеллюпозе экстракт наносят на хроматографическую колонку с КМ-целлюпозой (5Х60 см), уравновешенной в буфере

0,05 M ацетат аммония, рН 6,8, носле чего через колонку пропускают

0,05 М .ацетат аммония, рН 9,0 (2 л) и 0,37 карбонат аммония (2 л) со ско ростью потока через колонку 500 мп/ч.

Авидин элюируют ступенчатым градиентом концентрацией 0,4-1,07 карбоната аммония (в каждой ступеньке концентрация карбоната аммония увеличивается на 0,17), Элюат детектируют при

280 нм, фракции тестируют измерением активности авидина в них. Фракции, содержащие авидин, объединяют, На стадии выделения целевого продукта, раствор авидина диализуют против деионизованной воды до удапения солей и высушивают из замороженного состояния, Весь цикл выделения осуществляет» ся в течение 6 рабочих дней. Выход препарата 947, удельная активность

15,4 ед./мг, электрофоретическая чис» тота 99,37, соотношение А /А, ЮО 260 равно 1,78.

Процесс очистки авидина характери зуется данными в табл. 1, где приведено выделение авидина на 50 л яичного белка.

Пример ы 2-9. Обрабатывают

5 л яичного белка,1масштаб по срав» нению с примером 1 1:10. Операция го15 . могенизации яичного белка, фракциони рования сульфатом аммония, . осаждения органическим растворителем, хроматографии на KM-целлюлозе и выделения целевого продукта проводят как в при»

20 мере

В табл, 2 представлены численные значения концентраций солей, растворителей, рН экстрагента и качественные показатели процесса и целевого продукта после лиофильного высушивания, Предлагаемый способ позволяет получить авидин из яичного белка по упрощенной схеме, количество стадий сокращено в 2 раза (с 10 до 5) с выхо30 дом На 15 207

Фор мул а из о бр ет ения

Способ получения авидина из яично35 го белка, включающий гомогенизацию яичного белка, хроматографию содержащего авидин раствора íà KM-целлюлозе с поспедуницей элюацией, диализом и выделением целевого продукта путем лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличение выхода, гомогенизат осаждают сульфатом аммония в диапазоне концентраций 40-1007 насыщения, оса45 док Растворяют в воде lloBTOpHQ QcKK дают добавлением полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40-757 и авидин экстрагируют из осадка кислым буферным раствором при рН 1,0-6,0, экстракт хроматографируют на колонке с, КИ-целлюлозой.

Таблица

1643554

Гомогенизат яичного белка

Фр акционирование сульфатом аммония

Экстракт осадка после осаждения органическим растворителем

Элюат после

КМ-целлюпо зы

100

70000 57000 19900 0,0035

4000 77 19500 254

14,6

1 32

ll00

15,4

li2j

1200

Т ° вл н ц ° 2

Характеристика xo> euxoeo продукта пос» ле и>деления иэ влкнта с ЙФ.цаплю>оаи

Экстрахция рН

Припер

Фр екцною>ро в ание сульфатои анноиия

2 (насыие>е>е) Осакденне оргавияескин растворителеи, Х

Ие» танецл

2-Про- аце-; панол тон;

Электрофо- А i /А>аа ретнческая а>стога, Х

Вякал, Удел ьХ ыел активностьь ед./нг

Этнпояь>и спирт

1-е 2-е осаиденне осакдеине

75

40

70

Составитепb Ве ВОЛKoB

Текрад Л.Олийнык

Корр ектор Л. Бе скид .

Редактор Н,Бобкова

Заказ 1218 Тира7к 248 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раувская наб., д. 4/ 5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,301

l 00

IOO

I OO

О, t И глнцин/НС1

0> И глнцнн/НС1

О, t И ииндсьоп/НС1

0,1 M HC1

0,1 ИНС1

0,05 Н и>ещ атон/НС1

1 ИНС1

0,05 И трио/НС1

0,1 Н глицны/НС1

2,0 94

1,5 94

6,0 90

1,0 90

1,0 9

6,0 80

О 15

2,0 72

2,0 4

15,4

15 >2

14,9

15 1

10 >0

12,0

9,5

14,8

6>5

99 ° 3

99,2

99,0

99,0

95,0

97>0

90,4

98,2

71>0

1>78

I>,80

1,77

1 >68

1,55

1>56 ! >60

0,9

1,2