Способ получения полипептида, обладающего свойствами фактора высвобождения гормона роста

 

Изобретение относится к биохимии, а именно синтезу полипептидов, стимулирующих высвобождение гипофиз ..ого гормона роста у животных. Цель изобретения - упрощение способа. Способ заключается в том, что проводит твердофазный синтез пептида формулы H-Tyr-Ala-Asp-Ala-ILe-Phe-Ser- -Ser-Ala-Туг-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala- -Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu- -Gln-Glu-Leu-Leu-A a-Arp,-v, гле v -представляет собой ОН или Н группу путем соединения ВОС-замещенных аминокислот с подложкой из смоль:. Для образования пептида проводят последовательно блокирование и деблокирование боковой цепи, причем для блокирования выбирают защитную группу в зависимости от аминокислоты на конце боковой цепи. Отщепление -защитныхi групп и отрыв полипептида от смолы проводят смесью 1,5 мл анизола, 0S5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на 1 г системы пептид-смола в течение 0,5 ч /при 0-20° С. (Л

1 >)Z G 07 К 1/08 йьЫОВН игпи-ий ЬИЬЛ! МТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНЯТИЯМ

П1И ГКНТ CCO (2 l ) 4027997/13 (22) 22.08. 86 (31) 770683 (32) 29а08 85 (46) 23.05,91. Бюл К" 19 (33) US (71) Дзе Саак Институт фор Биолоджи« кал Стадиз (US) (72) Эмиль Томас Кайз ер (ЦБ) и Гонал Велиселеби (TR) (53) 575 224 ° 2;577.2/048/(088 ° 8) (56) Vale et al. Endocrinology.

1972, 91, 562-572, Ча1е et al. Endocrinology, 19531955 (1983), 112. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА ВЫСВО

БО11ДЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА (57) Изобретение относится к биохи мии, а именно синтезу полипептидов, стимулирующих высвобождение гипофиз. ого гормона роста у животных °

Изобретение относится к биохимии, а именно к синтезу пептидов, оказывающих влияние на функцию гипофиза у людей и животных, главным образом к пептидам, стимулирующим высвобождение гормона роста гипофизом, Целью изобретения является упрощение способа.

Такие пептиды могут быть синтезиро вавы т мер дофазным методом.

Спо соб заключается в то и, что ла бильные группы боковой цепи различных

Цель изобретения упрощение способа.

Спо соб заключается в том, что прово-. дят твердофазный синтез пептида формулы Н-Tyr-Аlа-Asp-Ala-ILe-Phe-Ser-Бег-А1а-Tyr=Arg-Arg-Leu-Leu-Аlа-G1n-Leu-Аlа-S er-Arg-Arg-Leu-Leu-GJ.n- 1u-Leu:-J,eu-Al а-Агр-у, где > — пред ставляет собой OH или H группу пу тем соединения ВОС-з амеще нных амино™ кислот с подложкой из смолы, Для об разования пептида проводят последо вательно блокирование и деблокирование боковой цепи, причем для блокирования выбирают защитную группу в зависимости от аминокислоты на конце боковой цепи. Отщепление защит ных групп и отрыв полипептида от смолы проводят смесью 1, 5 м1 анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на 1 г системы пептид-смола в течение 0,5 ч

1при 0-20 С ° аминокислотных фрагментов защищают с помощью подходящих защитных rpynn, которые препятствуют протеканию на данном участке химической реакции до тех пор, пока защитная группа не бу». дет полностью удалена. Традицион» ным приемом является защита альфа аминогруппы аминокислоты или фраг» мента во время. реакции системы по карбоксильной группе, после чего осуществляют селективнос удаление альфа-аминозащитной группы для про

1651 787

25 ведения последующих реакций, в соот ветствии с этим получают промежуточные соединения, которые включают аминокислотные остатки, расположенные в требуемой пос«тедовательности в пептидной цепи, где к соответствующим остаткам присоединены защитные группы боковой цепи, где ВОС - трет бутилоксикарбонил; MBIIA - смола;

0В Е1 — эфира-образующая з ащищающая группа для карбоксильнои группы, такая как Asp или Glu; Bzl —. бензил. гид1окси««защищающая группа для Ser;

Xan — з ащищающая группа для амидогруппы, такой как ксантил; TOS — защитная группа для имидазольног0 азота.

1I р и м е р .1. Синтез пептида

Ser 7, 8, 19 Ala 9, 15, 18, 28, Arg

12, 21, Leu 13,26, 27 — ЬЬВР (1-29)НН, отвечающего формуле Н-Tyr-Ala, Asp-Ala- Il e-Phe-S er-S er-Ala- Tyr- Arg-Ar g-Leu-Leu-Ala-G1u-Leu-Аl а-S er-Arg — Arg-Leu-Leu- Gln-Г1««-I,eu-1 eu-A1a-Arg-НН о суще ст вляют ступенч аЯ У то с использованием Beckman 990 пептидного синтеза на смоле МВНА. имею.щей интервал замещения 0,350,5 ммоль/г смолы, Соединение ВОС- 3

Arg (T0S) со смолой осуществляют по общей методике, описанной в патенте

США II - 4292313 (Vale), с использованием KP в среде ДМФ при 60 С в течео ние 24 ч при перемешивании» В резупьтате до стигают з амещение, равного

0 35 ммоль Arg на 1 r смолы„

После деблокирования и нейтрализации пептидную цепь постадийно выстраивают на смоле, Деблокирование, 40 нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют в соответствии с общей методикой. Все используе

«ь«е растворители тщательно дегазируют путем ««родувки инертным газом, напри мер гелием или азотом, с тем, чтобы обеспечить отсутствие кислорода

Деблокирование проводят в соответствии с режимом А, мин:

60Х ТФА/20Х этандитиол 10

60Х ТФА/2Х этандитиол 15 50

IPA/IХ этандитиол 0,5

Vr N (1ОХ) СН Сl 0,5

Ме ОН 0,5

Еt N (101) в СН Cl

3 Я. 2

0,5

МеОН (дважды) 0,5 . 55

СН С1 (дважды) .0,5

Операции сочетания проводят в соот ветствии с режимом Б, мин:

ДСС1

ВОС аминокислот а 50 90

МеОН. (дважды) О, 5

СН С1 (дважды) 0,5

Ас О (ЗМ) в СН С1 15,0

СН 01z 0 5

I«euH 0,5

СН С1 (дважды) 0 5

Описанные операции сводятся к следующему: 1-2 ммол ь BOG-з ащищенной аминокислоты в среде хлористого ме тилена используют на 1 г смолы, до бавляют 1 экв, 1,0 М раствора ДСС1 в хпористом метилене в течение 2.ч, В том случае, когда сочетанию подвер;гают ВОС-Arg (ТОЯ), используют смесь

50Х ДМФ и хлористого л«етилена, В качестве защитной группы гидроксила боковой цепи Ser H Thr используют бензиловый эфир, Амидогруппу Asn u

Gln защищают с помощью Хап в том случае, когда применяют ДСС сочета» ние, это является предпочтительным п-Нитрофениловый эфир (QNp) можно использовать для активации к арбо к сильного конца Asn или Gln и, напри мер, ВОС "Азп (ONp) можно подвергать конъюгированию в течение ночи с использованием 1 экв HOBt в 50Х-ной смеси ДМФ и хлористого метилена, и в этом случае ДСС не добавляют, Для боковой цепи Lys в качестве защитной группы используют 2-хлор-бензилокси карбонил (2сl-Z). Tos используют дпя защиты гуанидиногруппы Arg, а также имидазольного азота His, а карбоксильную группу боковой цепи Glu или

Asp защищают с помощью OBZ1. Фенольную гидроксильную группу Туг з ащищают 2,6-дихлорбенэилом (ДСВ), К концу синтеза получают следующую ком»позицию: ВОС-Tyr (Х ).-Аlа-Лзр(Х )-Ala-Ile-Phe-Ser-(X )-Ser-(X )-A1a— Tyr(Х )-Arg(Х )-Arg(Х )-Leu-Leu-Аlа-Сlп (Х )-Leu-Ala-Ser (Х )-Arg (Х )""

-Arg (Х )-Leu-Leu"Gln" (Х )-G lu(XR)-Leu-Leu-Ala-Arg (Х ).-Х, где Х ДСВ;

Х - ОВЕ11

X — Bzl

Х вЂ” Хап;

Х вЂ” TOS;

Х вЂ” подложку - HN-смоль« °

Хап полностью или частично удаляют обработкой ТФА, используемой для деблокирования а-амино защитной группы, 5 165

Для расщепления и снятия защитной группы с системы пептид-смола последнюю обрабатывают ),5 мл анизола, 0,5 ил иетилэтилсульфида и 15 ип фтористого водорода в расчете на 1 r системы пептид-смола в течение

0 5 ч при -20 С и в течение О 5 ч

Э при О.С» Йосле удапения HF в высо ком вакууме оставшуюся систему пептид смола попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид экстрагируют дегазированной 211 уксусной кислотой и отделяют от смолы фильтрацией °

Затем отщепленный и лишенный за щитной группы пептид растворяют в

О 5i-ном растворе уксуснои кислоты и подвергают очистке, которая может включать стадию фильтрации через мелкозернистый гель Сефадекс С-50»

Затем пептид подвергают дополнительной очистке методом препаратив ной ипи полупрепаративной жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPIC) . Состав хроматографич. ских фракций тщательно регулируют с помо щью HPIC и сливают лишь те фракции., которые имеют достаточную чистоту °

Обессоливание очищенных фракций не зависимо. проверенных на частоту достигается с использованием градиента

СН>СН в 0,1i-ной ТФА ° Затем центральный разрез подвергают лиофилизации с образованием желаемого пептида, имеющего чистоту выше 98Х.

Пример 2. Синтез пептида, имеющего ту же последовательность аминокислотных остатков, но в виде свободной кислоты, т.e. Ser 7,8, 19, Ala 9,15,18,28, Arg 12,21, Leu 13, 26, 27 — GPF (1-29)-0Н, отвечающего формуле: . Н-Tyr-A1a-Asp-Аlа-Е le-Phe-S e r-Ser-Ala- Tyr-Аг@-Ar g-L eu-Le u-A l a-G 1n-Leu-Аlа-Ser Àrg-Arg-Leu-Leu-Glu-G1u-Leu-Leu-А 1 а-Ar g-ОН, проводят ступенчатым методом с ис пользованием пептидного синтезатора

Beckman 990 на хлорметилированной смоле, имеющей интервал замещения

0,35-0,5 ммоль/г смолы. Соединение

ВОС-Arg .(TOS) со смолой проводят со гласно общей методике, используя в качестве растворителя хлористый метилен, в течение 2 ч при перемешивавии, добавляют 1 экв. 2N раствора

ДСС1 в хлористом метилене, В ре» зультате достигают степень замещения

)787 6

55 порядка 0,35 ммоль Arg на 1 г смоль!.

Остальные операции синтез а, включающие расщепление, снятие защитной группы и очистку, проводят согласно примеру 1 °

В соответствии с анализом, выпол ненным методом тонкослойной хроматографии и HPIC, установлено, что получен практически чистый пептид но» вого типа

Х может представлять собой под» ходящую защитную группу для феноль ной гидроксильной группы тирозина (Tyr), например, такую как тетрагидропнранил, трет бутил, тритил, Bzl, CBz, ч-Br -CBz и 2,6-дихиорбензил (ЛСВ) . Предпочти гельной защитной группой является 2,6-днхпорбензип, Х может представлять собой водо род, что означает отсутствие защитной

4 группы в боковой цепи аминокислотно» го о татка в этом положении. Х пред»

2 ставляет собой водород или подходя» щую эфирообрузующую защитную группу для карбоксильной группы аспаргина (Asp) или глутамина (Glu), такую как бензил (OBzI)., 2, 6-дихлорбензил, ме тил или этил

Х может представлять собой под ходящую защитную группу для гидро ксильной группы треонина (Thr) или сернна (Бег), например Bzl, 2,6-дихлорб енз ил и CBz. Предпочтит сльной, з ащи твой группой я вля ется 8z 1, Ф

Х, может представлять собой водород, что подразумевает отсутствие з ащит ной группы на .гидро ксил ьной группе Х4 представляет собои водород или подходяшую защитную группу для амидогруппы боковой цепи Аз1 или глицина (Сlп). Предпочтительно, такая группа представляет собой ксан» тип (Xan).

Х представляет собой подходящую защитную группу для гуаниднHO-ãðóïïû аргинина (Arg), такую как нчтро TOS, CBz, адамантилоксикарбонил, а также

В0С или водород

Выбор группы для защиты аминогруппы боковой цепи не имеет решаю» щего значения за исключением того, что обычно выбирают такую группу, которая не удаляется в ходе операции по снятию защитной группы у аминогрупп в ходе синтеза. Однако для некоторых аминокислот, например гисти» дина (H1s) обычно нет необходимости в защите после завершения соединения

1651787 и в этом случае защитные группы могут быть одинаковыми, Х представляет собой подходящую

9 защитную группу для С терминальной карбоксильной группы или представляет собой якорную связь, используемую в твердафазном синтезе для присоединения к падпожке из твердой смолы, или представляет собой des-X в том случае, когда осуществляют амидирование

Arg остатка по С™окончанию, В том случае, когда используется такая подложка из твердой смолы, она рассматривается как защитная группа н, соответствующие защитные группы такого типа могут быть выбраны из следую щих систем: О™СН -синтетическая подложка, -IK-бензгидриламин (ВНА)синтетиче ская подложка, или -NH- пара» метилбензгидриламин (NBHA) - синтетическая подложка B том случае, когда на С окончании желательно наличие незамещенной амидной группы используют ВНА или МВНА, поскольку расщепление непосредственно приводит к образованию амидной группы.

Твердофазный синтез начинается с С-терминального конца пептида путем конъюгации защищенной а амина» кислоты с подходящей смолой, Такай исходный материал может быть получен путем присоединения а-амино-защи щенной аминокислоты па средством эфирной связи к хларметилированнай смоле или гидроксиметилированнай смоле, или посредством амидной связи к ВНА смоле или ИВНА смоле.

С-Терминальная аминокислота, защищенная ВОС и ТОЯ, может быть вна чале конъюгирована с хлорметилираванной смолой или с ВНА или MBHA

cMoJIoH„ Ïoñëå коньюгации ВОС защищенной аминокислоты с подложкой из смолы а амина-защищающую группу удаляют, например, путем использования трифторуксуснай кислоты (ТГА) в среде хлористого метилена или только

TFA. Снятие защитной группы проводят при температуре ат 0 С до комнатной те мп ер а туры „

Каждая з ащище ниая амина ки сла т а или аминакислатная последовательность вводится в твердофазный реактор в, примерно четырехкратном или более высоком избытке и каньюгиравание может осуществляться в среде, представляк . щей сабо. < смесь диме тилфар м амид а (ДМФ) и СН „С 1 (l: 1 ), HJ1H каждое Н3

g0 рор который He TQEIbKo атшепля» т

35

55 указанных веществ в отдельности. В тех случаях, когда имеет место .неполное коньюгира ванне, операцию повторяют до удаления а аминазащитнай группы перед присоединением следующей аминокислоты Степень протекания реакции сочетания на каждой стадии синтеза, если реакцию проводят вручную, предпочтительно ре ги стри ру ется нингидриновой реакцией, Реакции са четания могут проводиться в автамати ческом режиме, например, в Бекманов ском автоматическом синтезаторе 990.

11осле завершения желаемой последа вательнасти аьмнокислот промежуточный пептид может быть удален с подложки из смолы в результате обработки таким реагентом, как жидкий фтаристый водапептид от смолы, но также отшепляет все оставшиеся защитные группы бока вой цепи Х, Х, Х, Х, Х, а также

Ф а аминозащитную группу, с получением амидированнага пептида. В0С-зашищающую группу удаляют вначале с использованием системы трифтаруксусная кислота - этандитиол до отшепления пептида ат смолы с. помощью Hk . При использовании для расщепления фтористого водорода в реакционный сосуд в качестве акцептаров вводят aHH30JI и метил э тил сул ьфид, Фар мул а изобретения

Способ получения палипептида, обладающего свойствами фактора высвобождения гормона роста. вклю" чающий очистку конечного продукта, отличающийся тем, чта, с целью упрощения способа, осуществляют твердофазный синтез пептида формулы

Н-Туr-Аlа-Аlа-Пе-Phe-Ser-Sег-Аlа-7yr-Arg-Arg-Leu-Leu-Аlа-G ln-Leu-Аlа-S er-Ar g-Агд-1 еи-Leu-G ln-G lu-Leu-Leu-Ala-Arg-Y, где У вЂ” ОН иги Ня"группа, путем соединения ВОС зашищенных аьж= накислот с MBHA или хлорметилираванной смолой для образования пептида, имеющего одну защитную группу ВОС:

-Tyr (Х ) -Ala-Asp (Х ) -Ala-I le-Phe-Ser(X )-Ser (Х )-Аlа-Туг(Х )-Arg (Х )-Arg (Х5)-Leu-Leu-Аlа-Сlп (Х )-Leu-Ala-Ser (Х )-Azg (Х )-Arg (Х )-Leu-Leu-Gln (Х )-Glu(X )-Leu-Leu-Ala-Arg(Х )-Х, 1651787

1О

Составитель: Н Кузенкова

ТехРеР у1. Пидык Корректор Н.Ревская

Редактор:Н.Гунько.Заказ 1612 Тираж 235 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

9 где Х, — 2,6-лихлорбензил, Х вЂ” ОВг1;

Х - Вг1

Ф

Х+ — Xan;

xr — To3;

Х «связь с полимерным носите9 лем, с последующим отщеплением защитных групп и отрывом пептида от полимер ного носителя с помощью смеси, со держащей 1,5 мп анизола, 0,5 мп ме5 тилэтилсульфида и 15 мп фтористого водорода в расчете на l г системы пептид смола в течение 0,5 ч при

0-20оС,