Способ твердофазного иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека и меченный биотином синтетический пептид для его осуществления

 

Изобретение относится к вирусологии и иммунологии, а точнее к способам определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов для этого. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ без уменьшения специфичности. Для этого используют в качестве антигена новый синтезированный пептид формулы биотин - GLY GLY TRP GLY CYS SER GLY LYS LEN ILE CYS THR THR ALA VAL PRO TRP-ASN-он, который наносят на предварительно сорбированный белок авидин или стрептавидин. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (т9) (т1) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4653296/30-13 (22) 01.03.89 (46} 07.12.90. Бюл. bh 45

P1) Институт биоорганической химии им.

M.M. Шемякина и Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (72) В.С. Иванов, З.К. Суворова, Л.Д. Чикин и А.Т. Кожич. (53) 616.078.73 (088.8) (56) йагчапеп А. et al. AIDS, 1987, ч. 2, р. 1119.

Gnann l.W. et al. Science, 1987, ч. 237, р.1346. (54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФ ЕРМ Е НТН ОГО ОПРЕДЕЛ Е Н ИЯ АНТИ-, ТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА

ЧЕЛОВЕКА И МЕЧЕННЫЙ БИОТИНОМ

СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ. Изобретение относится к вирусологии и иммунологии, точнее к способам определения антител к вирусу иммунодефицита челавека с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов для этого.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения антител и ВИЧ без уменьшения специфичности.

Пример 1. Синтез пептида формулы биотин-GlyGly TrpG lyCysSecGiyLysLeulleCys

ThrThrAlaVaIProTrpAsn- OH (1) осуществляют твердофаэным методом пептидного синтеза на синтезаторе "Beckmam-990", США ступенчатым наращиванием пептидной цепи.

B качестве носителя используют сополимер (я)ю 6 01 N 33/53, 33/68 С 07 К 7/08 (57) Изобретение относится к вирусологии и иммунологии, а точнее к способам определения антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) с помощью твердофазного иммуноферментного метода анализа с использованием синтетического пептида в качестве антигена и синтеза реагентов для этого. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ без уменьшения специфичности.

Для этого используют в качестве антигена новый синтезированный пептид формулы биотин-GlyGlyTrpGlyCysSer 61ф узрев(1е CysThr

ThrAlaValProÒrð-Asn-OH; который наносят на предварительно сорбировайный белок авидин или стрептавидин. 2 с.п.флы, 4 табл. полистирола с 1 $ дивинилбензола производства "BiO-Rad Laboratories", США.

Для защиты боковых функциональных групп используют следующие группировки: бенэильную (Brl) — для гидроксильных групп . серина и треонина, 4-метилбензильную (MeBzI) — для сульфгидрильной группы цистеина, 2-хлорбензилоксикарбонильную (CIZ)

-для е-аминогруппы лизина. В качестве временной защиты а -аминогрупп аминокислот используют трет-бутилоксикарбонильную (Вос) группу.

Аминометилполимеру (1,8 г, 1 ммоль) дают набухнуть в 30 мл СНС!з в течение 30 мин, затем присоединяют Вос-AsnOCHzCsH4CH2COOH (1,1 г, 2,9 моль) с помощью N,N-дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) (0,7 г, 2,9 ммоль) в 20 мл СНС!з в течение 2 ч, После промывки СНС!з Зх20 ми. аминоацилполимер обрабатывают 20 мл

1612264 смеси диизопропилэтиламин (ДИПЭА): уксусный ангидрид 2:1 в течение 30 мин для блокирования непрореагировавших аминогрупп полимера, Количество аминогрупп согласно нингидриновому тесту 0,95 ммоль (95 ).

Все аминокислоты присоединяют по следующей общей методике в виде оксибен, зотриазоловых эфиров: 2 ммоль аминокис лоты и 2 ммоль оксибензотриазола растворяют в 10 мл СНС1з, охлаждают до

0ОC и добавляют раствор 2 ммоль ДЦГК в 10 мл

CHCb, после перемешивания втечение

10 мин при 0"С к смеси добавляют 10 мл

ДМФА и приливают ее к пептидилполиме ру, перемешивают 1 ч при 30 С; затем промывают пептидилполимер ДМФА 3х20 мл,, СН С1з 3х20 мл.

Молекулу биотина присоединяют по

; следующей методике: пептидилполимер

; промывают диметилсульфоксидом (ДМСО) ! ЗХ 20 мл, 3 ммоль биотина и 3 ммоль окси. бензотриазола растворяют в 10 мл ДМСО и . добавляют 3 ммоль ДЦГК, после перемешивания при комнатной температуре в течение 10 мин смесь добавляют к пептидилполимеру, перемешивают 1,5 ч при 30 С и промывают ДМСО Зх20 мл, CHCI3 Зх 20 мл.

Для удаления временной защитной, :группы Вос используют смесь трифторук сусная кислота (ТФУ): СНС1з 1:1, содержа, щую 0,2 индола для предотвращения побочных реакций по триптофановому ос татку.

Стандартная методика. удаления Вос группы: промывка СНС!зЗх20 мл 5 мин, обработка смесью ТФУ:СНС1з (0,2 индола)

1:1 1х30 мл 20 мин, промывка СНС!з3x20 мл

5 мин, нейтрализация 7 -ным раствором

ДИПЭА в ДМФА 1х30 мл 10 мин, промывка

ДМФА 3х20 мл 5 мин, После сборки пептида получают 4,8 г пептидилполимера формулы биотинG IyGlyTrpGIyCys(Me Bre)-Ser(8 re)G ly-Lys(Clz)

-Leu - Ile-Cys(MeBre) Thr(Bz1) Thr(Bzl)Ala-ValPro-Trp-Asn-0СН2С6Н4СН2СО-полимер.

Деблокирование пептида с полимера с одновременным снятием всех защитных групп осуществляют следующим образом, 1,2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора для работы с фтороводородом "Sakaklba ra", Я пон ия, добавляют 0,5 г и-крезола и 0,5 г и-тиокрезола, после охлаждения сосуда жидким азотом и вакуумирования с помощью водоструйного насоса в сосуд перегоняют

10 мл безводного жидкого HF, Затем доводят температуру до ООС и перемешивают пептидилполимер при этой температуре в течение 1 ч, отсасывают HF на водоструй ном насосе в течение 20 мин, промывают полимер на фильтре диэтиловым эфиром, содержащим 1 меркаптоэтанола, для

5 предотвращения окисления цистеинов, Пептид экстрагируют 20 -ной уксусной кислотой, содержащей 1 меркаптоэтанола. После лиофилизации получают 328 мг неочищенного продукта.

10 Для восстановления сульфгидрильных групп цистеинов 60 мг пептида после деблокирования суспендируют в 2 мл смеси

ДМФА:НрО (рН 9) 1;1 и добавляют 60 мг дитиотреитола, продувают аргоном и переме15 шивают при комнатной температуре сутки.

Для выделения и очистки синтезированного пептида используют препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию на обращенной фазе на хроматогра20 фе "6!!зоп", Франция.

Для этого к суспензии пептида после восстановления добавляют 2 мл ТФУ для растворения осадка и раствор наносят на колонку Uitrasphere Octyl 10х250 мм ("Ды Pont", 25 США) и элюируют в системе 0,5 ТФУ в воде—

СНзОН при скорости 4 мл/мин и изменении градиента СНзОН от20до50 за 3 мин и от50 до 70 за 15 мин. Собирают пик, выходящий на 17 мин при детекции на 280 нм. После лио30 филизации получают 7,6 мг чистого пептида.

Чистоту и индивидуальность пептида подтверждают аминокислотным анализом (табл,1), масс-спектрометрически (табл. М 2) и аналитической ВЭЖХ в условиях выделения пеп35 тида на колонке ОЬз-Sphere Octyl 4,6х250 мм ("ДиРопт", США), время выхода 17,2 мин, При этом, кроме предлагаемого пептида (1), используют другие синтетические пептиды из последовательности белка gр41 вируса ВИЧ-1 формул

40 608

HzN-Тгрб!уСуз$ег6!у! уз! еШ1еСузТИг

623

ThrAlaValPro TrpAsn-ÎÍ (!!)

607

Н2Й-IleTrpGlyCysSerG lyLysLeulleCysThr.

ThrAlaVa! Pro TrpAsnAlaSer-ОН (ill)

HzNН eu6 Iyl le TrpG lyCysSerG lyLysLeul le, 50 616

Cys-ОН (1М

59 1.

Н2И-ArglleLeuAlaValGluArg TyrLeuLysAsp

611

55 GluGlnLeuLeuGlylleTrpGlyCysSer-ОН (V)

Пример 2. Анализ способности пептидов формул (1) — (\/) селективно связывать антитела против вируса иммунодефицита человека типа методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1612264

30

40

55

Для анализа используют 105 сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1, от больных

СПИД, СПИД-ассоциированным комплек-. . сом и бессимптомных вирусоносителей, 48 сывороток, не содержащих антител к ВИЧ1, но дающих положительную реакцию в иммуноферментной тест-системе "Антиген", СССР, 100 сывороток от здоровых доноров крови. Наличие антител в сыворотках крови подтверждается в нескольких коммерческих тест-системах.

Опыт проводят по следующей схеме.

Для пептидов П, !!!, IV, V пептид собирают на планшет для ИФА(типа "Со Star", США) иэ раствора 0 1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при

+4 С. После этого лунки промывают четыре раза 0,01 M фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натрия и

0,05% Твин-20 (ФСБ-Т). Для пептида I на планшет для ИФА (типа "Со star" ° США) сорбируют стрептавидин из 0,1 М фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при+4 С. После этого лунки промывают четыре раза 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,9% хлористого натрия и 0 05% Твин-20 (ФСБ-Т). Для опептида I на планшет для ИФА (типа "Со star", США) сорбируют стрептавидин из 0,1 M фосфатного буфера рН 8,0 в концентрации2 мкг/мл втечение ночи при+4"С. После этого лунки промывают четыре раза ФСБ-Т, Затем в лунки планшета вносят пептид I в

0 1 М фосфатном буфере рН.7,2, содержащем 4% хлористого натрия, 2% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т-А) в концентрации 0,2 мкгlмл и инкубируют 30 мин при 37 С. После этого лунки промывают четыре раза.

Далее в лунки подготовленных планшетов вносят образцы сывороток крови, разведенных 1:100 в ФСБ-Т-А, s объеме 100 мкл и инкубируют 30 мин при 37 С. Затем лунки четырехкратно промывают ФСБ-Т. В отмытые лунки вносят по 100 мкл конъюгата протеина А золотистого стафилококка с пероксидазой хрена в ФСБ-T-F в рабочем разведении. Планшет инкубируют 30 мин при 37оС. Затем лунки промывают четыре раза ФСБ-Т. В лунки планшета вносят по

100 мкл субстрата: 0,04%-ный раствор ортофенилендиамина в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0, содержащем 0,05% Н202 и инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темном месте.. Ферментативную реакцию останавливают добавление 2 н. раствора серной кислоты.

Величину оптической плотности измеряют при 492 нм на спектрофотометре P700 фирмы "Dynatec", ФРГ. Величину контрольного уровня определяют путем прибавления 0,250 к среднему значению оптической плотности контрольной сыворотки, не содержащей антител к ВИЧ-1.

Резул ьтаты опыта (табл. 3 и 4) показы вают, что предлагаемый пептид I выявляет все

105 ВИЧ-1-положительных сывороток (чувствительность 100%) и не выявляет ни одной ложноположительной сыворотки и сыворот-: ки здоровых доноров, что говорит о высокой специфичности пептида !.

Среднее значение ОПщ здоровых доноров для пептидов I-V соответственно:

0,048; 0,050; 0049; 0,047; 0,051; величина контрольного уровня: 0,298; 0,300; 0,299;

0,297; 0,301; процент узнавания (чувствительность): 105/105- 100%; 74/105-70,5 ;

74/105 — 70,5;57/105-54,3%,46/105-43,8%.

В таблице 3 приведены средние значения оптической плотности (ОПТ) по трем повторным опытам.

Результаты определения специфичности пептида I приведены в табл.4.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет повысить чувствительность способа определения антител к ВИЧ,в10 раэ уменьшить количество пептидного антигена в опыте определения антител к ВИЧ методом ТФИФА. Предлагаемый способ позволяет определять антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 при использовании соответствующих пептидных антигенов.

Предлагаемый способ и пептид I можно использовать в исследованиях развития гуморального ответа на внедрение вируса

ВИЧ и в целях серодиагностики СПИД.

Формула изобретения

1. Способ твердофаэного иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека, включающий взаимодействие антигена, представляющего собой синтетический пептид, с антителами тестируемой сыворотки крови и последующую регистрацию результатов указанного взаимодействия, о т л и ч а юшийся тем, что. с целью повышения чувствительности способа, в качестве пептидов используют меченный биотином синтетический пептид формулы

GlyGlyTr pGIyCysSerGIyZysZeclleCysThrThr

AlaVaIProTrpAsn-OH, который наносят на. белок авидин или стрептавидин.

2. Меченный биотином синтетический пептид формулы биотин6!у6!уТгр6!уСуэ$е! 6!у1 уз! еи!!еСузТЬгТЬгА!а

VaIProTrpAsn-0Í + для определения антител к вирусу иммунодефицита человека.

1612264

О х

Ф

С: о с о

Ф. с о

Е:

ВЕ ЛсчЬО

c0сч c3 ОOc0

O С0 Q «СЧ

Ф

Б о

Ф

Р о с («1 в

Ф т » с о (:"..

Б

IФ

D. о z

Ф

I- o О .1 Г-.

СЧ «1 СЧ «- «- ««» СЧ «» «» «- «О.

О

Ф

I- o ь — Ф:«.ФФ.С=Ф т сп а. - В О 1- -O < CtIÕ .

I- G О Я 1 1 I- I- 2 D 0 с(C (. ) Iо

K о

Ха

Х

Б о о

Ф о

С:

«- LfP t Cb О> C С Ъ O СЧ СЧ С ) СЧ

СЬС ) СО«-«" - OO ОСО -О

Oсч О««Фсч ««» «»«-с«)«СЧ «- % %- «Ф СЧ I «-б% I % СЧ Сф) «»

«- Cb C0 C0 O t» O Л O Ж СЧ

Лo. С ЪО)OCÎË«-СЧСЧС )

«СЧ «-О«»«»«-СЧ«-«»«» счсчсчсч - счсчсч -ОЕ Л-eC0tOO

««ОООО«»«»«»«О

СЧСЧC «- ««» «»СЧ ««»«вЂ”

С ) ID Cb Л O Со СО О Л Co CO

COIN | rr.ВВС0«ГООOCb

-rt ОOОО«- «-«-О

1612264

Табл и а2

0.787

0.987

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

>2

1,615

1,026

1,652

>2

>2

0,800

0,432

1,500

1,211

0,542

>2

1,032

>2

0,507

0,062

0,182

0,096

0,220

0,182

0,294

0,532

0,131

0,675

0,375

1,280

0,056

>2

0,346

0.441

0,112

0,612

0,858

1,957

0,732

1,980

>2

1,447

0,998

2,027

0,7:18

1,457

Образцы сывороток крови

2

4

6

8

10 11

12

13

14, 15

16

17

18

19

21

22

23

24

26

27

28

29

3f

32

33

34

36 . 37

38

39

41

0,137

0,303

1,209

1,773

0,633

0,271

0,922

0,957

>2

1,140

0,350

0,373

0,806

0,301

0,082

0,412

1.543

>2.

0,032

0,115

1.490

0,422

0,083

0,863

Пепти ы о мл

0,002

0,100

>2

0,914

1,124

0,791

0,228

0,901

0,627

1,166

0,811

0,880

0,380

0,852

1,028

0,110

1,110

1,620

>2

0,200

0,220

0,674

0,727

0,200

0,820

0,053

0,289

0,120

0,474

0,170

0,238

0,620, 0,220

1,153

0,570

1,136

0,052

>2

0,036

0,620

0,066

0,620

0,006

0,108

0,533

0,487

1,359

0,207

0,520

0,064

0,467

0.904

0,000

0,420

0,000

0,998

1,434

0,010

1,026

1,593

0,483

0,105

0,020

0,000

0,024

0,120

0,933

0,000

0.352

0,024

0.520

0,126

0,084

0,260

0,063

0,300

0,194

0,136

0,053

0,098

0.263

0,193

0,059

0,685

Таблица3

0,008

1,169

0,912

1,077

1,756

0,053

0,048

0.189

0,445

1,447

0,000

0,229

0,000

1,830

1,433

0,120

0,837

0,912

0,980

0,020

0,730

0,440

0,14А

0,280

1,720

0,000

0,220

0,062

0,980

1,152

0,118

1,222

0,031

0,157

0,063

0,099

0,543

0,020

0,733

0,282

0,038

0,030 !

1612264

Пепти

ы омл

Образцы сывороток крови

Продолжение табл,З

0,712

1,500

1,815

0,088

0,158

0,059

0,180

0,450

0,000

1.314

0,920

0,153

0,576

>2

1,510

1,393

1,025

>2

>2

1,133

0.,494

>2

>2

>2

>2

>2

0,903

0,425

0,749

0,360

>2

0,490

1,106

1,520

> 2.

1,512

0,166

0,520

0,490

0,501

0,303

0,424

0, 329

82

83

84

86

87

88

89

91 92

43

44

46

47

48

49

51

52

53

54

56

57

58 ! 59

61

62

63

64

66

67

68

69

71

72 . 73

74

76

77

78

79

Э

1,470

>2

>2

1,271

>2

>2

>2

>2

>2

>2

> 2

>2

>2

>2

<2

1,697

0,768 1,620

>2

>2

>2

>2

1,678

>2

>2

>2

1,688

1,777

0,703

0,738

1,765

>2

0,679

> 2

0,718

"f,012

0427

G,542

0,039

0,344

0,970

0,140

0,055

0,885

1,160

0,491

0,153

>2

>2

1,865

>2

>2

1,162

0,121

0,555

>2

> 2

0,317

2,100

> 2 .> 2

1,493

>2

> 2

2,100 и

1,700 г. 2

0,833

0,412

0,092

0,403

0,482

0,357

0,207

0,174

0,520

0,702

0,623

0,101

0,274

0 668

236»

166

751

62 "» ,135 ,609 ,315 ,347

„018

0,066

0,186

1,025

0,117

0,580

0,933

0,2 12

0,055.

>2

1,920

1,071

0,120

>2

>2

>2

>2

>2

>2

0,240

1,540

>2

> 2

0,420 и

> 2

>2

>.2

>2

>2

>2

> 2

> 2

> 2 i »283

0,450

0,129

0,503

0,985

0,458

0,297

0,249

0,520

> 2

> 2.

0,161

0,295

О;660

0,235

0,081

G,920

>2

О„ i17

0,329

>2

1,947

0,697

>2

0,300

0,302

1,236

0,135

0,049

0,012

0,673

0,107

0,147

0,249

0,558

1.015 . 0,5V2

0,202

0,439

0,156

0Ä210

0.065

0,685

0,911

558

93

96

041

0,038

0,080

0,260

0,240

1,128

0,220

0,072

0,160

>2

0,290

0,768

0,420

0,895

>2

> 2

> г

>2

О, 106

0,420

0,140 l,250

0,330

0,368

0,119

> 2

0,260

0,219.

>2

>2

1,487

0,606

0,204

1,863 . >2

0,053

0,131

0,017

0,173

0,634

0,030

0,061

0,139

1,130

>2

0,255

0,704

0,040

0,228

0,038

О 030

0,156

0.275

0,139

0,282

0.284

0,024

13

1612264

Продолжение т

Составитель С.Светлышев

Редактор И.Горная Техред М.Моргентал Корректор А.Обручар

Заказ 3829 Тираж 529 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101