Штамм virus japonici еnсернаliтidis для приготовления диагностических и профилактических препаратов

 

Использование: вирусология, Оригинальный штамм вируса японского энцефалита (ЯЭ), клон № 3, выделен из культур клеток головного мозга мышей-сосунков, хронически инфицированных клоном 33 вируса японского энцефалита, на 422 день со дня заражения клеток с последующим трехкратным клонированием из бляшки. Инкубационный период составляет 3-4 дня для новорожденных белых мышей. Инфекционный титр составляет 6,5 Ig LDso/мл. Взаимодействие штамма с культурами клеток девятидневных куриных эмбрионов происходит в форме острой инфекции, сопровождается деструкцией клеток; при роллерном выращивании вирус накапливается в культуральной жидкости этих культур до 10,5 Ig БОЕ/мл и продуцирует в среду гемагглютинины в титре до 1:256 (оптимум рН 5,4) Боратио-солевые и сахарозоацётоновые антигены , приготовленные из штамма, агглютинируют эритроциты гуся в титрах 1:1024-1:10240 соответственно в широкой зоне рН. Штамм высокочувствителен к эфиру , хлороформу и дезоксихолату натрия, снижающим титр вируса на 4,0 Ig БОЕ/мл Штамм обладает высокой антигенной активностью и широтой связей с антигенами штаммов Накаяма, Пекин-1, Джагар 01, ДВК-4 вируса ЯЭ, имеющимися в коллекции лаборатории. Культуральные и мозговые антигены штамма отличались высокой иммуногеннои и протективной активностью , Штамм используется для приготовления специфических диагностических препаратов (антигенов, иммунной асцитическойжидкости, моноклональных антител), а также для разработки культуральнойинактивированной вакцины против японского энцефалита, которые успешно могут быть использованы для диагностики и идентификации вновь выделенных штаммов вируса ЯЭ, для изучения иммунного статуса и для профилактики заболеваний в эндемичных по японскому энцефалиту районах. Штамм депонирован р Государственной коллекции вирусов под номером 677. 5 табл С/ С х| ел ю о. О)

С0103 СОВГТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4843422/13 (22) 27.06.90 (46) 30.07.92. Бюл. N. 28 (71) Институт вирусологии им. Д, И. Ивановского (72) П, Г. Дерябин и Н. В. Логинова (53) 616.988(088;8) (56) бочкова Н. Г., Корешкова Г. В.,Погодина

В. В. Изучение очагов арбовирусных инфекций, передаваемых комарами, — "Вопросы вирусологии", 1981, N 5,,с. 611-615.

Эльберт Л. Б.,Семенов Б, Ф.,Карасева

П, С. и др. Инактивированная вакцина против японского энцефалита. Характеристика очищенного препарата из мозга мышей.—

Вопросы вирусологии. 1983. М 2, с. 196-200. ! (54) ШТАММ VIRUS JАPONICI

ЕИСЕРНА! !Т!Э!Я ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Использование: вирусология, Оригинальный штамм вируса японского энцефалита (ЯЭ), клон N 3, выделен из культур клеток головного мозга мышей-сосунков, хронически инфицированных клоном 33 ви-. руса японского энцефалита, на 422 день со дня заражения клеток с последующим трехкратным клонированием из бляшки, Инкубационный период составляет 3-4 дня для новорожденных белых мышей. Инфекционный титр составляет 6,5 Ig ЮБл/мл. Взаимодействие штамма с культурами клеток девятидневных куриных эмбрионов происИзобретение относится к медицинской вирусологии.

Известны штаммы вируса японского энцефалита (ЯЭ), используемые для приготов,, Ы„, 175 I203A1 ходит в форме острой инфекции, сопровождается деструкцией клеток; при роллерном выращивании вирус накапливается в культуральной жидкости этих культур до 10,5 Ig

БОЕ/мл и продуцирует в среду гемагглютинины в титре до 1:256 (оптимум рН 5,4).

Боратно-солевые и сахарозоацетоновые антигены, приготовленные из штамма, агглютинируют эритроциты гуся в титрах

1:1024 — 1:10240 соответственно в широкой зоне рН. Штамм высокочувствителен к эфиру, хлороформу и дезоксихолату натрия, снижающим титр вируса на 4.0 Ig БОЕ/мл.

Штамм обладает высокой антигенной активностью и широтой связей с антигенами штаммов "Накаяма", "Пекин-1", "Джагар

01", "ДВК-4" вируса ЯЭ, имеющимися в кол лекции лаборатории. Культуральные и мозговые антигены штамма отличались высокой иммуногеннои и протективной активностью, Штамм используется для приготовления специфических диагностичес ких препаратов (антигенов, иммунной асцитической жидкости, моноклонал ьных антител), а также для разработки культуральной инактивированной вакцины против японского энцефалита, которые успешно могут быть использованы для диагностики и идентификации вновь выделенйых штаммов вируса

ЯЭ, для изучения иммунного статуса и для профилактики заболеваний в эндемичных по японскому энцефалиту районах. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером 677. 5 табл. ления диагностических и профилактических препаратов (1,2-штаммы "Пекин-1" и "Накаяма" вируса ЯЭ), депонированные в Государственную коллекцию вирусов, являютс

1751203 производственными штаммами для разработки диагностических и профилактических препаратов, необходимых для работы в регионах СССР (Дальний Восток), эндемичных для ЯЭ, Однако эти штаммй характеризуются рядом недостатков . отсутствие широких антигенных связей не позволяет эффективно выявлять антитела к различным вариантам вируса ЯЭ в сыворотках людеи и животных в эндемичных районах при использовании диагностических препаратов, приготовлен10 ных на основе этих штаммов; для наработки культуральных диагностических и профилактических препаратов на основе этих 15 штаммов необходимо использование дорогостоящих первичных клеток, сред и сывороток вместо экономичных и доступных культур клеток куриного эмбриона, в которых известные штаммы вируса ЯЭ слабо 20 рейродуцируются, и, следовательно, и репараты, приготовленные на основе штаммов вируса ЯЭ в культурах клеток куриного эмбриона, характеризуются слабой антиген25 ной, иммуногенной и протективной активностью. Использование высокопатогенных штаммов вируса ЯЭ для производства диагностических препаратов и профилактических средств требует дополнительных затрат для обеспечения безопасности персонала при работе с вирусом.

Целью изобретения является получение штамма вируса ЯЭ, характеризующегося широким спектром антигенных связеи, вы- сокой репродуктивной активностью в куль- 35 турах клеток куриного эмбриона, низкой нейровирулентностью, обладающего высокими показателями иммуногенной активности, предназначенного для приготовления диагностических и профилактических препаратов (антигенов, иммунных асцитических жидкостей, культуральной инактивированной вакцины), которые могут быть использованы в практике работы ряда арбовирусных лабораторий страны для изучения иммунитета среди людей и животных и для идентификации вновь выделенных штамПоставленная цель достигается путем использования оригинального штамма вируса японского энцефалита клона N 3.

Штамм Virus Japonicl encephalitidis выделен из культур клеток головного мозга мышей-сосунков. хронически инфицированных клоном 33 вируса ЯЭ (3) — штамма

"Накаяма", на 422-й день со зня зара>кения культур с последующим трехкратным клонированием иэ бляшки, мов вируса ЯЗ в эндемичных .регионах, а также для профилактики заболеваний ЯЭ, 50

При идентификации штамма вируса ЯЭ с набором иммунных асцитических жидкостей к вирусам, относящимся к различным антигенным группам, установлена его антигенная связь со штаммами вируса ЯЭ "Пе кин-1" "Джагар 01", "Накаяма", "ДВК-4".

Штамм вируса ЯЭ хранится в лаборатории генетики арбовирусов Института вирусологии им. Д; И, Ивановского АМН СССР и в Государственной коллекции вирусов под регистрационным номером ГКВ-677.

Штамм характеризуется стабильным проявлением биологических признаков.

Физико-химические признаки.

Индекс инвазйвности — 6,5 lg ЛДво. Индекс инактивации дезоксихолатом натрия—

4,5. Индекс термоинактивации — 2,0 (при прогревании в течение 20 мин при 50 С).

При фильтрации вируссодержащей суспен зии через миллипоровце фильтры размером

100 и 50 нм на снижение инфекционного титра не наблюдали. Это свидетельствует о том, что штамм вируса имеет размеры до 50 нм и содержит в csoeM составе липопротеидную оболочку. На основании морфологи- ческих, морфогенетических и антигенных признаков выделенный штамм вируса отнесен к семейству Flavividae штамму вируса японского энцефалита, Культуральные свойства.

Взаимодействие штамма вируса ЯЭ с культурами клеток различного происхдждения (СПЭВ, ВНК, 4647) происходит в форме острой инфекции, сопровождает деструк цией клеток с накоплением вируса в культуральную среду в титрах 7,0-7,5 lg ТЦД5оlмл.

Аналогичные значения титров вирус достйгает в этих культурах и при титровании методом бляшек (под агаровым покрытием).

Штамм вируса ЯЭ (ГКВ-677) характеризуется высокой репродуктивной активностью при титровании в культурах клеток куриного эмбриона, вызывает цитопатогенный эффект при заражении 24-часовоГо монослоя клеток и накапливается в среде этих культуру в титрах до 9,5 lg БОЕ/мл или ТЦД5оlмл, при роллерном выращивании титры вируса колеблются от 10,0 до 10,5 Ig E/мл, при этом в среде зараженных культур накапливаются гемагглютинины в титре до 1;256.

Антигенные свойства.

Антигенные свойства штамма изучены в перекрестных реакциях: РТГА, реакции биологической нейтрализации, B реакциях использовали гипериммунные асцитические жидкости мышей к штаммам; "Накаяма", "Джагар 01", "Пекин-1", "ВК-4" и к гомологичному штамму — клону й. 3 вируса ЯЭ. В

РТГА использовали боратно-солевые антигены этих штаммов(8 — 16 АЕ), в РБН 100 БОБ

1751203 ний х 15-му дню после последней иммунизации, и вируснейтрализующих антител, способных нейтрализовать 4,0-4,5 lg гомологичного и изологичного (штамм "ДВК-4" вируса ЯЭ) вируса. эмбрионов, Для заражения используют 10

БОБ на клетку каждого из этих штаммов и после часового контакта неадсорбировавший вирус удаляют и вносят после трехкратного промывания монослоя ростовую среду

45 (среда 199) с 0,1 гидролизата лактальбуми50

Диагностический препарат — антиген из штамма вируса ЯЭ вЂ” получают путем внутримозгового заражения новорожденных белых мышей. Из мозга животных, взятых на на и 1% сыворотки крупного рогатого скота (для кул ьтур клетбк почек сирийского скота— для клеток куриного эмбриона). Сбор вируссодержащей жидкости проводят в оптимальные для каждого вируса сроки (на 3-й день для штамма "Пекин-1" и через 24 ч для штамма клона М 3), Полученные сравнительные результаты приведены в табл. 4, Таким образом, предлагаемый штамм для производства культуральных диагновысоте клинических проявлений заболева- 55 ния, готовят антиген путем сахарозо-ацетоновой экстракции по методу D. clarke, J, Casals. Диагностическую иммунную асцитическую жидкость готовят по методу С. Я. Гайдамович с соавторами. на клетку вируса в виде мозговой суспензии .Профилактический препарат (культузараженных мышей-сосунков, По данным ральную инактивирьванную вакцину, готоРТГА и РБН штамм вируса ЯЭ имеет близ- вят из культуральной жидкости, собранной коеантигенноеродствосоштаммами "Джа- из инфицированных штаммов вируса ЯЭ

rap 01", "Накаяма", "ДВК-4", "Пекин-1". 5 культур клеток куриного эмбриона, выраВ табл. 1 представлены антигенные свя- щенных роллерным споСобом и инактивирози штамма вируса ЯЭ,:. ванной формалином в концентрации 1:2000.

В табл. 2 представлены сравнительные . Пример 1. Лабораторная диагностиданные антигенной активности штамма ви- ка инфекцйи, вызванной вйрусом ЯЗ у мы- руса ЯЭ (данные РТГА).: 10 шей в условиях эксперимента.

Из данных табл. 2 видно, что штамм Материал для исследованйя — сыворотвируса японского энцефалита характеризу- ки крови мышей, инфицированных штамется широкимспектромантигенныхсвязей мом "Джагар 01" вируса ЯЗ, взятые в с различными вариантами вируса ЯЭ, начальном периоде нелетальной инфекции

Биологические признаки.. :-.: . 15 .и через 20-25 дней; Проводят постановку

Штамм вируса японского энцефалита серологических реакций РТГА и РБН с ися вляется слабо-патогенным вариантом для пользованйем сахарозо- ацетойового антимышей линии Bala/с и беспородных живо- гена, приготовленного из штамма вируса ЯЗ тных. У зараженных мышей вирус вызывает и его культурального антигена. Реакции статипичную картину менингоэнцефалита с ин- 20 вятся по общепринятому методу. кубационным периодом 4-5 дней. Вирус па- Результаты исследований сывороток тбгенен при внутримозговом введении приведены в табл. 3 с использованием станмышам; максимальные титры (в логарифмах дартных и предлагаемых диагностикумов.

ЛД о) составляют 6,5-7,0. При периферйче- .. Таким образом, использование предласком введении мышам- массой более 7 г 25 гаемого штамма для приготовлениядиагноштамм йе вызывает Заболеваемости и гибе- " стических препаратов способствовало ли животных. Индекс инвазивности штамма повышенйю диагйоСтической эффективносоставляет 6,5-7,0. Вирусоспецифическая сти лабораторных исСледований у мышей, РНК штамма, выделенная из культуральной инфицированных вирусом японского энцежидкости, собранной с зараженных культур 30 фалита, клеток курйного эмбриона, обладает инфек- Пример 2. Получение вирусосодерционными свойствами как для культур кле- жащей культуральной жидкости, необходиток, так и для мйшей при внутримозгоаом мой для производства культуральных введении материала.." .. диагностических и профилактических пре Иммуйогенные свойства. .. 35 паратов на основе производственного

Двукратная (подкожная и внутрибрю- штамма "Пекин-1" in предлагаемого клона шинная) иньекции с интервалом в один день N 3 вир )са ЯЭ. культуральной жидкости, собранной через: . Материал для исследования — произ24 ч после заражения штаммом вируса ЯЭ водственный штамм "Пекин-1" и авторклеток куриного эмбриона и содержащей, 40 ский штамм — клон N 3 вируса ЯЭ, а также как правило 10 Ig БОЕ/мл вируса ЯЭ, бе- монослойклетокпочкисибирскогохомячка, лым мышам сопровождается появлением у используемый для пройзводства культуних специфических антигемагглютининов в ральной инактйвированной вакцины японтитре до 1:320, достигающих таких значе- ского энцефалита, и 9-дневных куриных

1751203 стических и профилактических препаратов акцию ставят в микромодификации по о6позволяет использовать более экономич- щепринятому методу. ные и доступные культуры клеток куриного Результаты исследований приведены в эмбриона, обеспечивает" получение препа- табл. 5. ратов в короткие сроки с высокой антиген- 5 Из табл. 5 видно, что культуральный ди- . ной активностью и содержанием вируснйх агностикумдля РТГА, полученный наоснове: частиц высокой концентрацией, что позво- авторского штамма вируса ЯЭ, в ряде случае. лит почать эффективные диагностйческие и позволяет с большей эффективностью выявпрофилактические препаратй — " лять антитела к вирусам ЯЗ в сыворотках

ll.р и м е р 3. Вйявление вирусспеци- 10 здоровых людей по сравнению с коммерчефических антител в сыворотках людей в Ха- ским культуральным диагностикумом, что барбвском крае.: " "" свидетельствует о преимуществе данного

Матерйал для йсследования - с ворот- диагностического препарата для изучения ки крови людей, полученные из Хабаровско- популяционйого иммунитета в очагах флаго НИИЭМ. Сыворотки изучают в РТГА с, .15 вивирусных инфекций.. использованием коммерческо го фил ьту рального диагностикума к вируСу японского Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я энцефалита и культурального диагностику-: Штамм Virus)ароп}с! encephallidis ГКВ ма, полученного на основе авторского 677,-для йриготовлейия диагностических и штамма сайруса японского энцефалита, Ре- 20 профилактических "препаратбв.

Таблица 1

Таблица 2, Таблица 3

1751203

Таблица 4

Основные параметры, характеризую@ив репродукциЮ штаммов вируса яЭ в культурах клеток.

Таблица 5

Антитела в сыворотках людей к вирусам японского энцефалита.

Составитель П.Дерябин

Редактор Н,Швыдкая Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь

1 Заказ 2665 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101