Способ очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец

 

Использование: в прикладной биохимии выделения ферментов, чувствительных к окислению. Сущность изобретения: на стадии фракционирования сульфатом аммония гомогената в качестве сульфата аммония используют препарат квалификации для спектрального анализа ТУ 6-09-4087-75 2 ил,, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/10

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕЙИЯ

0,0005

0,0005

0,0005

0,0005

0,00001

0,00001

0,00001

0,00002

Алюминий

Кальций

Кремний

Магний

Железо

Кобальт

Никель

Медь

Мышьяк, олово, свинец, сурьма

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4823666/13 (22) 07:05,90 (46) 07.08.92. Бюл, !Ф 29 (71) Институт молекулярной биологии им.

В,А.Энгельгардта (72) В.М.Кочкина (56) Кочкина В.M., Торчинский Ю.М. Очистка аспартат-трансаминазы из цитоэоля ку:риных сердец, — Биохимия, 1976, т. 41, N 6, с.812 — 818, Кочкина В,М., Азарян А.В, и др. Улучшенн н ый метод очистки аспартат-трансаминазы из цитоэоля куриных сердец и характеристика препаратов фермента. — Биохимия, 1978, т. 43, N 8, с. 1478 — 1484. ь

Изобретение относится к медицине, в частности к прикладной биохимии.

Известен способ очистки аспартаттрансаминазы иэ цитозоля куриных сердец путем фракционирования сульфатом аммония и этанолом с последующей кристаллизацией.

Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта, так как на стадии фракционирования сульфатом аммония примеси ионов металлов приводят к частичной инактивации фермента, в результате которой имеет место недостаточно полный выход получаемого белка.

Целью изобретения является повышение вйхода целевого продукта при сохранении наивысшей для данного белка удельной активации.

Поставленная цель достигается тем, что содержание ионов металлов в препарате сульфата аммония, используемого для фракционирования, составляет, мас.0/, не более:.. Ж,» 1752768 А1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ АСПАРТАТ-ТРАНСАМИНАЗЫ ИЗ ЦИТОЗОЛЯ КУРИНЫХ СЕРДЕЦ (57) Использование: в-прикладной биохимии выделения ферментов, чувствительных к окислению. Сущность изобретения: на стадии фракционирования сульфатом аммония .гомогената в качестве сульфата аммония используют препарат квалификации "для спектрального анализа" ТУ 6-09-4087-75. 2 ил „1 табл.

Отсутствие спектральных линий

На фиг. 1 приведены данные гельэлектрофореза; на фиг. 2 — диаграмма.

Пример. Сердца измельчают на мясорубке, заливают 1,5 об. холодной дистиллированной воды, содержащей 1 мМ ЭДТА, и оставляют для экстракции на ночь при 40С.

После экстракции фарш отделяют центрифугированием (2500 об/мин, 20 мин), К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 40 насыщения (степень насы3 1752768 щения указана для 25 С), через 30-40 мин образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (300 об/мин, 30 мин). К суперI натанту добавляют пиридоксаль-5 -фосфат (10 мкг/мл) и сульфат аммония (до 70 насыщения). После добавления сульфата амо мония раствор оставляют на ночь при 4 С.

Выпавший осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 40 мин), растворяют в

0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 и диалиэируют против такого же буфера от солей в течение 24 ч при 4 С. После диализа

1 к раствору добавляют пиридоксаль-5 -фосфат(10 мкг/мл), предварительно растворенный в буфере рН 6,0, и а -кетоглутарат (до

10 мМ конечной концентрации), приготовленный на 0,125 М калий-фосфатном буфере так, чтобы конечное значение рН раствора было равно 5,0-5,1. и начинают осаждение этанолом.

Для осаждения берут небольшие порции (лучше по 100 мл) ферментного раствора, к ним приливают сразу всю порцию охлажденного до -50 С этанола (к 100 мл ферментного раствора необходимо прилить

120 мл этанола) до конечной концентрации

52 /,, Выпавший осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин) и отбрасывают, а затем концентрацию этанола в супернатанте повышают до 70,5 . Для этого осаждения нет необходимости делить ферментный раствор на небольшие порции, поэтому этанол (охлажденный до -15 С), приливают сразу ко всему обьему ферментного раствора. Осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин), заливают небольшим объемом 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5 и оставляют на ночь при

4 С для экстракции фермента. От нерастворившегося осадка экстракт отделяют центрифугированием (15000 об/мин, 30 мин) и диализируют от этанола против 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5. Отдиализованный раствор концентрируют, высаливая его сульфатом аммония (500 мг к 1 мл раствора), а затем высоленный осадок фермента растворяют в 0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 таким образом, чтобы концентрация белка в растворе была не менее

30 мг/мл.

Далее кристаллизуют фермент, для чего к холодному раствору небольшими порцияими в течение 1 ч добавляют сульфат аммония до насыщения 42, После добавления всей навески сульфата аммония пробирку с

0,0005

0,0005

0,0005

0,0005

0,00001

0,00001

0,00001

0,00002

Алюминий

Каль,ций

Кремний

Магний

Железо

Кобальт

Никель

Мед

Мышьяк, олово, свинец. сурьма

50

Отсутствие спектральных. линий

55 ферментным раствором оставляют в холодной бане на 10-15 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 15 мин) для удаления механических примесей, а в прозрачный

5 раствор вносят затравочные кристаллы, Пробирку с раствором плотно закрывают и помещают в холодильник. На следующий день выпадают кристаллы фермента, их отделяют от маточника центрифугированием

10 (6000 об/мин, 15 мин) и растворяют в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,5.

По данным горизонтального гельэлектрофореза на пластинке в полиакриламидном геле (фиг. 1) и последующего

15 сканирования геля на ULTROScan x L (фиг.

2) чистота фермента составляет 99 при наивысшей для данного фермента удельной активности, равной 70000 ед/мг, Выход чистого цитозольного фермента

20 составляет 78 от общего количества указанной трансаминазы в экстракте и 70 от общего:.оличества суммарной активности двух трансаминаз — цитозольной и митохондриал ьной. Митохондриальная трансамина25 за, обладающая отличающимися от цитозольной физико-химическими свойствами и являющаяся в данном случае примесным белком, отделяется на 1-й стадии очистки, 30 Схема очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец (данные на 1 кг сердец) представлена в таблице, Формула изобретения

Способ очистки аспартат-трансамина35 зы из цитозоля куриных сердец, включающий фракционирование сульфатом аммония, фракционирование этанолом и кристаллизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого

40 продукта, фракционирование проводят сульфатом аммония, содержащим ионы металлов в количестве, мас.f, не более:

1752768

500мят 250ииг 1У)икг 50икг 12мкг Ем ю .Фю.1

40 50 60 70 60 00 100 110 120 170 Ф0 150 160170 8/i

РигР

Редактор В.Петраш

Заказ 2734 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина,.101

17

16

14

1, 3

1Г

11

0У а7

06

05 а ог

Составитель В.Кочкина

Техред М.Моргентал Корректор О.Юрковецкая