Способ определения активности амилазы надмембранного слоя энтероцитов экспериментального животного

 

CO)03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУГ..ЛИК (51)5 С 01 И 3 /88

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ЙЗОБРЕТЕНИЯ > ь

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4794884/14

{22) 26.02,90 (46) 07.08.92. Бюл, M 29 (71) Гродненский государственный медицинский институт (72) П.M.Êoðàëåâ (56} Уголев Н,М, и др, Распределение адсорбированных и собственных кишечных фермен10в между клетками слизистой тОнкОЙ кишки и отделенным от них аникальным гликокаликсбм. ДАН, l978, т. 241, ¹ 2, с. 491494. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ НАДМЕМБРАННОГО

СЛОЯ ЭНТЕРОЦИТОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГОО Х(ИВОТНОГО (57) Изобретение относится к области зкспериментальной гастрознтерологии, Целью изобретения является прибли>кенле к физиИзобретение относится к экспериментальной гастрознтерологии и может использоваться для прижизненного определения активности ферментов,адсорбированных в надмембранном слое знтероцитов(НСЭ) лаббраторных животных, Известен способ изучения мембранного пищеварения, предусматривающий определение ферментативной активности НСЭ.

Способ включается биопсию слизистой оболочки тонкой кишки (ТК), помещение биоптата в охлажденный раствор Рингера при рН среды 7,0-7,4, десорбци,о адсорбированных на поверхности слизистой оболочки ТК ферментов (й-амилазы) с получением фрак- . ции 91, 82 и 03 фермента (соответственно легко, трудно десорбируемая амилаза), ценгрифугирование полученных фракций, йнку„„ Ж„„1753422 А1 ологическим условиям. Способ включает введение в просвет сегмента тонкой кишки подогретого 3%-ного раствора агар-агара, извлечение агаровой реплики после ее застывания, взвешивание, гомогенизацию, инкубацию 03p33U08 с ciубстратом и ФОТО- метрическое определение ферментативной активности по степени гидролиза субстрата, Исследуемый сегмент тонкой кишки заполняют раствором агар-а гара с предварительно добавленным в него дозированным количеством субстрата, после чего сегмент оставляют в брюшной полости на время инкубации субстрата с ферментами надмембранного слоя знтероцитов, à определение ферментативной активности последнего осуществляют без дополнительного процесса инкубации вне организма, . табл. бацию фракции с субстратом (0,1%-íый рас твор крахмала) в течение 30 мин при температуре 38 С и фотометрическое определ"-.èèe активности фермента по убыли субстрата.

Недостатками известного способа являются необходимость 3-кратного смыва био-,. птата для десорбции адсорбированных на поверхности слизистой оболочки ТК, т,е. в

НСЭ, ферментов, а также проведение процесса инкубации субстрата с ферментами вне организма, что снижает точность исследования.

Наиболее близким техническим решением является способ определения ферментативной активности апикального

Гликокаликса знтерОцитов, включа1ощий введение в просвет изолированного от орга1753422

Акт!лвность амилазы аце !ивалась в мг гидра45 пизованного крахмала на 1 кг агаровой реГ0 низиа сегмента ТК подогретого pacTBopd

arap-агара в виде золя, извлечение,rapoBOI" реплики после ее застывания, взвешивание, гомогенизацию, инкубацию гамогената с субстратом и фотометрическас апредепе 5 ние ферментативнай активности по убыли субстрата.

Недостатком известного способа лвляется то, что otto прОВОдитсл на изалирс!3анном от организма сегмента ТК, вследствие чего процесс инкубации субстрата с ферментами13}СЭ осущ>ес-:вллется вне органл"; ма, что снижает до определенной степени результаты исследования, Цель иэобрете!!ил — пр!Лбли>кение к фи- 1 зиолОГич6ски!и успа Риям.

Способ ссуществлл!От следующим образом.

Животное после предварительного голодания на протяжении 14-16 и наркотизируют известным «Oco}3 »i фикси!2ук>т брюшком кверху, Праизводлт срединну!о лапаратоми10. В сперационну10 рану BblRoдят сегмент TI(. На концах сегмента надсек а к?? сто н ку Т К и «е }3 8 3 0 б р а 3 О В а В L! i и 8 с я

ОТВЕ, СТ!18 Осуществпя!От ItpoVI;I BBI IN8 rloitoсти сегмента охпа>кденным изстониче?Схим

pr3cTBop0M хл О}зиДа натрия (}4 Г X I !). Д иста п ьный конец сеГмoнта кишки закpûaa!Oò >1игатурсй., которую проводлт через 3 . бессосудистую зону брыжейки, Через OT" верстие в проксимапьном отделе сегмент с помо.цью шприца заполняют подагретыи

Да 4 2 С 3 о - н b!b! pa c!" В 0 }3 О м а Г а !3-а rа p а кейки, Заг10лне!! 1 и сег}лен; ТК погружают в бр ашну!а полость иа время 4 лнкубации субстрата с ферментами г}СЗ, КраЯ Операц!ланной pat!bi сбГ1!л>}(9!От за><имами и абкладыва!от салфетками, смоченными B теплом NPXI- Па истечении необходимого времени инкубации исследуемый сегмен1 извлекаlат В Опе}>ацланнуlа рану, разрезают вдоль, извлекают arapoayto реплику, Взвешива!от и гсмагенизиру от 66 в охлажденном NPXH, в который с цельio прекращенил гидр пиза субстрата добавляют 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Гомогенат реплики центрифугируют при 5000 аб/мин на протяжении 10 мин. В надосадочной жидкос-;и фотаметрически определяют ферментативную активность по 5 степени гидролиза субстрата. .П p H и 8 р, В oribIT берут i ;pblc>k-сам ц

МассоА 780 г. В целях стандартизации условий зксп8римента испсльзу}ст жиВОтнсе после предварительнсгс голодания на г!ротлжении 16 ч (без лишения воды). Зксперимс:Iò проводят в утреklèèå часы (Iëk.>êäó 9 и 10 часэии). Животного наркотиз!Лру!от путем Внутрибзр!Ошин!!Ого введения натрия тиопентала (50 мг/кг массы тела), фиксиру

10т б}31сшксм кве}эху !л праизВОДЛ г с}3РДинну!а лапаратоми:о, В операционную рану, ОГступп 5 см От 2-ПР}ЗстнОЙ кишки, !ЗывОДлт сеГмен Г К Длиной 3 см, }"i}30TI1Borto>1t(t ыР концы сегмента надсека!ат, через образоBaB!3Iиесл отгерстил промыва!от сегмент 4,0 ип 0><ла>!<ДЕннс?гс (+40С) 17РХ}-}, Лис гол ь11ьи,-1 конец сегмента кишки закрывают лигатурой, катару!о проводят;ерез бессосудистую зону брыжейки, Через отверстие в прокслмально" отделе сегмент с п<змощьЮ шприца заполня!ат подогретым да 42"С 3%-ным раствором агар-агара с предварительна добавленным B него дазлрованным копичествсм субс1рата (0,1 г растворимого крахмала на 100 ил pañтВОра аГара, смссь т!цатеГ1ьнО перемсшива, or с помощью магнитной мешалки). Проксимсапьньил конец сегмента

KMLIIKI? Закрыaа!ат лигатурÎЙ, провеценной через бессосудистую зону брыжейки па расстг>я ",ии ? см От дис1альна на>lожен1!Ой Г!!1гтуры, Заполненный сегмент пагр/>Kaioг В бр!Ош}!у!о палас Гь !, а 15 мин (В земл инкубации субстрата с ферментами IC3), Крал операционной раны сблл>ка!От и обкпадываioT салфетками, смоченными в тс-:плам

I4PXI- -}ерез 15 r" ин после заполнения сегме;па последнии р,:зреа-,iàò Вдаль, извпека-! Ог а-арОвуIÎ ре !пику, гзвеtJJèваlÎт ее и гсмагенизиру!от в охлажденном ИГ?Х}-! (3,0 ип), в который с цел!Яо прекращения гидропиза субстрата добавпя!От 1 мп 10%ного раствора трихларуксусной кислоты. !

"смоге!!ат реплики центрифугиру>от при

5000 об/иин на протяжении 70 мин, 2,0 мп надосадочной жидкости используют дпя определения ферментативной актиBности

Г>:-амипазы по степени гидролиза субстрата ппи!ки B 1 с.

Предлагаемым способом осуществпе-!!о определение ферментативной активности }-}СЗ у 18 белых крыс-самцов массой

1<>0-220 г, I ottTpofibH)10 группу >к!лвсп!Лых, v которых определение указанного rIOKàçaT8ля проводили известным способам, состаВили 12 белых крыс-самцов аналогичной массы тела, Обоснован!ле Воспроизводимости (тсч-!!Ости) способа определения представле !0 В таблице, Анализ приведенного источника показывает. что зксперииент по извес п-!аму способу начинается с декапитации животных, 1753422

Статистические показа

Известны ество ис ледованных жив нее арифметическое значе

Ошибка среднего арифметичес CpepHåe квадратическое отклон

Коэффициент вариации (Чх} Достоверность различия

1.

1 по критерию Стьюдента) 12

237

+. 12

41,57

17,54 %

t= 3,8

Р< 0,091

Составитель Л.Конюхова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор M.ØàðoLUè

Редактор Н,Химчук

Заказ 2166 Тира>к . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 все дальнейшие процедуры осуществляются вне организма, отрезок кишки, заполненный агаром, помещается на 15 мин в ледяную банджо, а затем агаровая реплика извлекается и подвергается исследованию, 5

В предлагаемом же способе исследуемый сегмент кишки заполняют раствором агара непосредственно в брюшной полости, при этом в агар предварительно добавляют дозированное количество субстрата и инку- 10 бацию субстрата с ферментом осуществляют в условиях живого организма.

Таким образом, положительный эффект изобретения cocTav e or«, art> процесс инкубации фермента с субстратом осуществ- 15 ляется в при>кизненных условиях.

Формула изобретения

Способ определения активности амилазы надмембранного слоя энтероцитов экспериментального живбтного, включающий введение в просвет сегмента кишки подогретого раствора агар-агара, извлечение его после застывания, взвешивание, гомогенизацию, инкубацию образца с субстратом в течение 15 мин с последующим фотометрическим измерением ферментативной актив- ности, о тл и ч а ющи и ся тем, что, с целью приближения к физиологическим условиям, . сегмент кишки заполняют содержащим субстрат агар-агаром непосредственно в брюшной полости и проводят инкубацию в условиях организма животного.