Рекомбинантная плазмидная днк pil-2/21, кодирующая человеческий интерлейкин-2, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент человеческого интерлейкина-2

 

Использование: молекулярная биология и генетическая инженерия. Сущность изобретения: полученная рекомбинантная плазмидная ДНК plL-2/21 имеет мол. вес 2,5 Md и содержит Pstl-Xhol фрагмент ДНК плазмиды pDST2+o с терминатором транскрипции ID и 3 - концевой частью /3-лактамазы, Pstl-EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pBR322 с 5 - концевой частью гена /3-пактамазы; EcoRI-EcoRI фрагмента фага М13 грлп с промоторно-операторной областью гена rec A. Proteus mirabilis, а также синтетический Haell-SalGI фрагмент ДНК, кодирующий ген интерлейкина-2 человека, адаптированного для эффективной экспрессии в клетках E.coli. Плазмида plL-2/21 сконструирована путем последовательного клонирования фрагментов в векторах pBR322 и pDSt +o, штамм продуцент интерлейкина-2 получен трансформацией клеток E.coli SG 20050 этой рекомбинантной плазмидой. Уровень синтеза белка интерлейкина-2 в сконструированном штамме составляет 30-35% от общего количества клеточного белка, что соответствует 45-50 мг/л (3-4 х 108 МЕ/л), 3 с.п.ф-лы. (/

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1st)s С 12 N 15/26, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4892494/13 (22) 19.12.90 (46) 15.09.92, Бюл. М 34 (71) Научно-производственное объединение

"Вектор" (72) Н.К.Данилюк, Т.П.Камынина, B.Â,Êðàâченко, Л.С.Сандахчиев и А,Н.Синяков (56) Авторское свидетельство СССР

М 1440033, кл. С 12 N 15/00, 1987. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДHAR

ДНК plL-2/21, КОДИРУЮЩАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ИНТЕРЛЕЙКИН-2, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERICHIA C0LI — ПРОДУЦЕНТ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (57) Использование: молекулярная биология и генетическая инженерия. Сущность изобретения: полученная рекомбинантная плазмидная ДН К рll -2/21 имеет мол. вес 2,5

Md и содержит Pstl — Xhol фрагмент ДНК плазмиды pDST o с терминатором трансИзобретение относится к медицине, биотехнологии и генетической инженерии, и может быть использовано для получения человеческого белка интерлейкина-2 в клетках Е.coli.

Целью изобретения является создание бактериального штамма-продуцента человеческого IL-2, обеспечивающего высокое содержание целевого белка в биомассе, Для этого сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК plL-2/21, обеспечивающая экспрессию гена человеческого интерлейкина-2, состоя щая из: — EcoR 1-EcoR 1-фрагмента ДНКфага М1з

rpm с регуляторной областью гена rec А

Proteus mirabilis; — фрагмента ДНК с синтетическим геном IL-2 человека и инициирующим ATG-кодоном;

„„!Ж „„1761805 А1 крипции 2+о и 3 — концевой частью P ëàêтамазы, Pstl-EcoRI фрагмент ДН К плазмиды

pBR322 с 5 — концевой частью гена P-лактамазы; EcoRI-EcoRI фрагмента фага М13

rpm с промоторно-операторной областью гена rec А, Proteus mirabilis, а также синтетический Haell-SalGI фрагмент ДНК, кодирующий ген интерлейкина-2 человека, адаптированного для эффективной экспрессии в клетках Е.cali. Плазмида plL-2/21 сконструирована путем последовательного клонирования фрагментов в векторах

pBR322 и pDSt o, штамм продуцент интер2+ лейкина-2 получен трансформацией клеток

Е,coli SG 20050 этой рекомбинантной плазмидой. Уровень синтеза белка интерлейкина-2 в сконструированном штамме составляет 30 — 35% от общего количества клеточного белка, что соответствует 45-50 мг/л (3 — 4 х 10 МЕ/n), 3 с,п.ф-лы. — плазмидного вектора, обеспечивающего терминацию транскрипции гена и селективный отбор клонов по устойчивости к ампициллину, Для получения plL-2/21 синтетический ген человеческого IL-2 соединяют последовательно с олигонуклеотидом, содержащим ATG-кодон, и регуляторной последовательностью rec А из Proteus

mirabilis и интегрируют в векторную плазмиду pDSt2+0.

Рекомбинантную плазмидную ДНК plL2/21 трансформируют в клетки Е.coli SG

20050, в которых проводят экспрессию гена человеческого 11=2. Индукцию регуляторной системы Proteus mirabilis осуществляют митогеном типа митомицина С. Синтез белка

IL-2 в клетках фиксируют методом электрофореза в ПААГ, а его идентификацию — с

1761805 помощью иммуноферментного анализа и биологической активности, Штамм Е.coli SG(plL-2/21) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки, Клетки прямые, палочковидной формы 1,5 х 2,0 х 6,0 мкм, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на агаризованных средах образуют колонии гладкие, круглой формы, блестящие, серые, край неровный, мутные, При росте в жидких средах, мясопептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть, Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 10 — 40 С при оптимуме рН 6,8 — 7,6, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности, глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу, В качестве источника азота используют минеральные соли в аммонийной и нитратной формах и в органической форме — пептон, аминокислоты, нитраты, восстановленные до нитратов.

Желатину не разжижают. Уреазная активность не обнаружена. Индол не образуют.

Устойчивость к антибиотикам. Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазMèäû р!! -2/21, и растут в при концентрации ампициллина от

20 до 100 мкг-мл, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под номером ВКМВ5542.

Уровень синтеза IL-2 в сконструированном штамме составляет при плотности культуры 10 клеток/мл около 50 мг/л или

30 — 35 от общего количества клеточного белка, что позволяет рассматривать сконструированный штамм как продуцент, потенциально пригодный для получения белка !! -2.

Пример 1, Конструирование рекомбинантной плазмиды pB IL-2, 10 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды

plL-2 последовательно гидролизуют рестриктазами Нае II и Saic сначала в 100 мкл буфера 1(50 мМ трис-HCi, рН 7,5, 10 мМ

MgClz, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мМ

NaCI), а затем в буфере 2(50 мМ трис-HCI pH

7,5, 10 мМ Ng CI2, 120 MM NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол) в течение 3 ч при 37 С. Нае

II-SalG !-фрагмент (399 п.о,) выделяют в 6%

ПААГ.

1 мкгДНК плазмиды pBR 322 совместно гидролизуют рестриктазами EcoR I (5 ед.) и

SalG (5 ед.) в буфере 2 1 ч при 37 С. EcoR !

-SalG I-фрагмент (3710 п,о,) выделяют из

0,8 агарозы, Смесь 0,25 пкмоль EcoR !SalG I- векторной формы pBR 322, 1 пкмоль

Нае !!-SalG !-фрагмента р!!=2 и 20 пкмоль фосфорилированного олигонуклеотида

AATTCATGGCGC выдерживают в 30 мкл лигазного буфера (20 MM трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ М9С!г, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ

АТФ) с 10 ед Т4-ДН К-лигазы 16 ч при 10 С.

Реакционную смесь нагревают 10 мин при

70 С, добавляют dNTP до 1 мМ концентрации, 5 ец. ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и выдерживают еще 10 мин при 10 С. 10 мкл смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli JM 10 . Из колоний, имеющих фенотип Ар, Тс, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную pBIL-2, и проводят Nar I и (EcoR !-SalG !)-рестрикционный анализ. Правильность структуры нуклеотидов в области сайтов EcoR и SalG подтверждают методом Максама-Гилберта.

Пример 2, Конструирование рекомбинантной плазмиды pR IL-2, 20 мкг репликативной формы ДНК фага

M13 I pm гидролизуют в 100 мкл буфера 2 50 ед, рестриктазы EcoR I 1 ч при 37 С. EcoR

I-EcoRI-фрагмент (198 п,о.) выделяют в 6/

ПААГ, 1 мкг ДНК плазмиды pBIL-2 гидролизуют в 20 мкл буфера 2 рестриктазой Ecor в описанных выше условиях, Смесь 0,25 пкмоль линейной формы pBIL-2, пкмоль (EcoR I-EcoR I)-фрагмента М!з rpm и 10 ед, Т4-ДНК-лигазы выдерживают в 50 мкл лигазного буфера 16 ч при 10 С. 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli

JM 10 . ДНК рекомбинантных клонов анализируют с помощью (Sma I-SalGI)-гидролиза, Первичную структуру рекомбинантной ДНК

pRIL 2 подтверждают методом МаксамаГилберта.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмиды plL-2/21.

10 мкг ДНК pRIL-2 гидролизуют последовательно в 50 мкл буфера 1 и буфера 2 эндонуклеазы рестрикции Pst (20 ед,) и

SalG I (20 ед.) Рм !-SalG I-фрагмент (1359 п,о.) выделяют электрофорезом.

10 мкг плазмиды pDSt о гидролизуют г+ совместно эндонуклеазами рестрикции Pst ! (10 ед.) и Xho (10 ед.) в 50 мкл буфера I 1 ч при 37 С. (Pst I-Xho I)-фрагмент выделяют электрофорезом в 4 ПААГ, Смесь 0,25 пкмоль линейной формы pDSt o, 0,25 пкмоль Pst !-SaIG I-фрагмента pRIL-2, и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфе1761805 ра выдерживают 16 ч при 10 С. 10 мкл используют для трансформации компетентных клеток Е.coli JM 10 . Из колоний, имеюз щих фенотип Apr, выделяют ДНК плазмиды

plL-2/21 и анализируют ее эндонулеазами

Bsp! и Есог I, Пример 4. Экспрессия гена IL-2 в клетках Е.coli SG-20050.

Рекомбинантную плазмиду plL-2/21 трансформируют в клетки Е,cali SG20050.

Бактериальные клетки культивируют в 5 мл

LB-среды при 37 С до плотности

D5500=0,6 — 0,7, затем всредудобавляют митомицин С до концентрации 1 мМ и культивируют еще 4 часа в тех же условиях, 1 мл клеточной суспензии центрифугируют и клетки ресуспендируют в 100 мкл лизирующего буфера (0,15 M трис-HCI, рН 6,8, 10м М

2-меркаптоэтанол, 2/ SDS, 5/ глицерин, 0,1/ бромфеноловый синий). 10 мкл полученного лизата наносят на 15 / ПААГ с 1

SDS и проводят электрофорез. Пластину геля обрабатывают 1 ч 10О/ ТХУ в 20/-водном этаноле, после чего помещают в 0,25 /о раствор Кумасси R-250 на 30 мин при 56 С, затем выдерживают в 70 уксусной кислоте в этаноле. Содержание IL-2 в клеточном лизате составляет 30 — 35/ от общего количества белка.

Пример 5. Иммуноферментный анализ клеточных лизатов штамма-продуцента человеческого IL-2.

Клетки штамма Е.coli SG 20050, содержащие плазмиду plL-2/27, выращивают в 5 мл LB-среды в присутствии 1 мкм митомицина С при 37 С до плотности Dssp=7. Суспензию клеток центрифугируют при 20 С 2 мин, 5000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а клетки ресуспендируют в 400 мкл

ТЕ-буфера, К 10 мкл полученной суспензии клеток добавляют равные объемы воды и лизирующего буфера. Смесь выдерживают

3 мин при 100 С, 10 мкл лизата наносят на

15 / ПААГ с 1 / SDS и проводят электрофорез по Леммли, По окончании электрофореза пластину геля накрывают нейлоновым фильтром и проводят электроэлюцию 1 ч при силе тока 70 мА, Фильтр переносят в

1,5% раствора ВСА и желатина, приготовленный на буфере 3 (25 мМ трис-HCI, рН 8,0, 150 MM NaCI, 0,05/ твин 20), и выдерживают 1 ч при 20 С, Затем добавляют мышиные моноклональные антитела к человеческому интерлейкину-2 до концентрации 10 мкг/мл и выдерживают 12 — 16 ч при 20 С, Фильтр тщательно отмывают буфером 3 и инкубируют при 20 С в течение 2 ч с кроличьими антителами против мышиных IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена. Фильтр отмывают буфером 3; для окрашивания полос

его помещают в 6 мл 0,050/ 2-хлорнафтола в 15 водном этаноле, содержащем 80 мМ трис-HCI (рН 7,5) и добавляют 10 мкл 30/ перекиси водорода, Пример 6, Определение биологической активности рекомбинантного IL-2.

Клетки штамма Е,coli SG 20050, содержащие плазмиду plL-2/21, выращивают в 5 мл LB-среды в присутствии 1 мМ митомицина С при 37 С до плотности Dssp=7. Суспензию клеток центрифугируют при 20 С (2 мин, 5000 об/мин). Надосадочную жидкость удаляют, а клетки ресуспендируют в 2 мл фосфатного буфера и разрушают ультразвуком, Осадок собирают центрифугированием и растворяют в 2 мл 6М гуанидинхлорида. Раствор центрифугируют (15 мин, 10000 об/мин), супернатант диализуют против фосфатного буфера 14 — 16 ч при

4 — 6 С. Биологическую активность полученного лизата определяют по методу Гиллиса.

Содержание человеческого IL-2 в клеточном лизате составляет (3 — 4) 10 ме/л. в

Формула изобретения

1, Рекомбинантная плазмидная ДНК

pIL-2/21, кодирующая человеческий интерлейкин-2, размером 3.72 тыс. п.о, и мол.м.

2,5 Md и содержащая: — EcoR I-EcoR I — фрагмент ДНК фага

М13 rpm размером 0,2 тыс, п.о. с регуляторной областью гена rec А Proteus mirabilis: — Pst I-Xhol — фрагмент ДНК плазмиды

pDSt p размером 2 38 тыс. п.о.с терминатог+ ром транскрипции t p и 3 -концевой частью гена устойчивости к ампициллину; — Pst I-EcoR I — фрагмент ДНК плазмиды

pBR 322 размером 0,74 тыс. п.о. с 5 -концевой частью гена; — Hael l-SalG I — фрагмент ДН К плазмиды

plL-2, 0,4 тыс. п.о., с синтетический геном человеческого IL-2: — генетический маркер: Ыа — ген устойчивости к ампициллину; — уникальные сайты: Psf I, Smal u Pvull.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК р!(=2/21. кодирующей человеческий интерлейкин-2, закл ючающийся в том, что последовательно лигируют синтетический ген IL-2 человека с искусственным олигонуклеотидом AATTCATGGOGC, регуляторной областью гена rec А Proteus mirabilis, а затем с Rstl-Xhol — фрагментом pDSt p, и трансформации полученной лигазной смесью клеток Е.coli M103 с последующим отбором колоний, содержащих целевую плазмидную ДНК.

3. Штамм бактерий Escherichia coli BKM

В-5542 — продуцент человеческого интерлейкина-2,