Способ подготовки ооцитов крупного рогатого скота для анализа

 

Использование: цитология, фиксация и окрашивание женских половых клеток крупного рогатого скота. Сущность изобретения: ооциты фиксируют в смеси воды, метанола и формалина, взятых в соотношении 2:1:1 в течение более 2 ч, после чего обрабатывают охлажденным этиловым спиртом и окрашивают смесью лакмоида, уксусной кислоты и генцианового фиолетового.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (sl)5 G 01 N 33/4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4853660/13 (22) 20.07.90 (46) 23.09.92. Бюл. N- 35 (71) Институт биохимии АН УЗССР (72) Д,Х.Хамидов, ТЯ).Коваль и Г.Н.Аблятипова (56) Chang G., Janagimachi R., J. exp. Zool.

1963, v.154, р. 175-187, Изобретение относится к способам фиксации и окрашивания женских половых клеток крупного рогатого скота до и после культивирования в среде.

Изобретение может найти применение при культивировании половых клеток.

Известен способ фиксации и окрашивания половых клеток экспериментальных животных (мыши, крысы) по методу

Чанга. Фиксирующий раствор состоит из воды:метанола:формалина в соотношении

1;1; I, фиксация проводится в течение 40-60 минут, затем переносят в охлажденный этиловый спирт на 1 ч, после чего клетки переносят на предметное стекло и окрашивают лакмоидом 0,12% в уксусной кислоте, покрывают покровным стеклом и производится анализ хроматина под фазовым контрастом.

Данный способ не эффективен для ооцитов крупного рогатого скота. т;к. они более крупных размеров d--130-150 мкм (у мышей, крыс — 60-80 мкм) и обладают высоким содержанием липидных капель, а (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ООЦИТОВ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ АНАЛИЗА (57) Использование; цитология, фиксация и окрашивание женских половых клеток крупного рогатого скота. Сущность изобретения: ооциты фиксируют в смеси воды, метанола и формалина, взятых в соотношении 2:1:1 в течение более 2 ч, после чего обрабатывают охлажденным этиловым спиртом и окрашивают смесью лакмоида, уксусной кислоты и генцианового фиолетового. это делает невозможным анализ состояния ядра и хромосом.

Целью изобретения является контрастирование ядра и хромосом ооцитов крупного рогатого скота до и после культивирования, сокращение времени просмотра.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе изменяется соотношение частей 2:1:1 фиксирующего раствора вода:метанол:нейтральный формалин, время фиксации 2 часа, концентрация лакмоида

0,24% в 45% уксусной кислоте с добавлением генцианового фиолетового 0,002% раствора.

Сопоставительный анализ заявленного способа с прототипом показывает, что заявленный способ отличается от известного, тем что изменяется соотношение компонентов фиксатора, длительность фиксации и способ окрашивания. Таким образом, заявленный способ соответствует критерию изобретения "новизна", 1763981

Через три часа фиксации из первой группы брали последнюю N. 3 чашечку и зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96 этиловый спирт, из второй группы брали чашечку М 3 и клетки переносили в спирт, и из третьей группМ брали чашечку N- 3, клетки также переносили в спирт. Все три чашечки ставили в холодильник на час или на ночь.

После фиксации ооцитов всех трех групп готовили тотальные препараты. Пастеровской пипеткой ооциты переносили на

10 обезжиренное предметное стекло, окрашивали 1 каплей раствора лакмоида 0,24 раствор в 45 уксусной кислоте и 1 каплей

0,002 раствором генцианового фиолетового, покрывали покровным стеклом и готовый препарат просматривали под фазовым контрастом фотомикрос капа М БИ-15.

Анализ состояния окрашивания хромосом и ядер, показал наиболее оптимальный вариант для ооцитов крупного рогатого скота вторая группа фиксирующего раствора вода:метанол:нейтральный формалин в соотношении 2:1:1, время фиксации 2 часа, Уменьшение концентрации фиксатора водой создает большую гипотонию, которая

25 вызывает набухание клеток и увеличение размеров пор, через которые проходят красители и улучшается окрашивание структур ядра.

Использование заявляемого изобретения позволит: — анализировать состояние ядра, хромосом в ооцитах крупного рогатого скота; — сократить время просмотра клеток, Формула изоб ретения

Способ подготовки ооцитов крупного рогатого скота для анализа, включающий фиксацию ооцитов в смеси воды, метано30

40 ла и формалина, обработку охлажденным

Составитель С

Техред M.Mop

Редактор Т. Куркова гентал Корректор 3. Салко

Заказ 3454 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

11 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Известен способ фиксации и окрашивания половых клеток мышей и крыс в котором используется фиксирующие растворы и окрашивание ядра и хроматина. Однако, при указанном способе не удается увидеть ядро и хромосомы в ооцитах крупного рогатого скота и велики потери клеток, затраты времени и труда при просмотре препаратов, которые исключаются в заявленном техническом решении. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию "существенные отличия".

Примеры конкретного выполнения.

Готовили фиксирующие растворы состоящие из воды:метанола:нейтрального формалина. Были взяты три группы фиксирующих растворов. Первая группа — фиксирующие растворы в соотношении 1:1:1.

Раствор разливали в три чашечки; время фиксации 1 ч, 2 ч и 3 ч. Вторая группа; соотношение 2:1:1, растворы тоже разливали в три чашечки: время фиксации 1 ч, 2 ч и

3 ч, Третья группа — соотношение компонентов 3:1:1, растворы также разливали в три чашечки, время фиксации 1 ч, 2 ч и 3 ч. Все чашечки сверху надписывали и ставили в холодильник на 60 минут. Затем готовили окрашивающие растворы из лакмоида в концентрации 0,24 в 45o уксусной кислоте и генциановый фиолетовый 0,002 раствор.

Половые клетки — ооциты до и после культивирования, освобождают от клеток кумулюса и пастеровской пипеткой переносят в охлажденные фиксирующие растворы.

Через час брали из первой группы чашечку

М 1. зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96 этиловый спирт, из второй группы брали чашечку М 1 и клетки переносили в спирт, и из третьей группы чашечку N- 1, клетки тоже переносили в спирт. Все чашки ставили в холодильник на

1 ч или на ночь, По истечению двух часов фиксации из первой группы брали чашечку N. 2, зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96 этиловый спирт, из второй группы брали чашечку N 2: клетки тоже переносили в спирт, и из третьей группы чашечку М 2, клетки также переносили в спирт. Все три чашечки ставили в холодильник на час или на ночь, этиловым спиртом с последующей окраской смесью лакмоида и уксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью

45 повышения разрешающей способности анализа, воду, метанол и формалин s смеси используют в соотношении 2:1:1, фиксацию проводят более двух часов, смесь для окрашивания дополнительно содержит 0,002 g

50 раствора генцианового фиолетового, лакмоид используют в концентрации 0 24, а уксусную кислоту — в концентрации 45 t,.

Завражнова