Способ диагностики болезни марека

 

Использование: ветеринарная вирусология . Сущность изобретения: для оценки эпизоотической обстановки в птицехозяйствах от птицы берут из подкрыльцовой вены кровь и исследуют на наличие антител к основному белку миелина. Положительная реакция свидетельствует о заболевании болезнью Марека.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4776626/13 (22) 03.01.90 (46) 30.01.93. Бюл, N 4 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (72) И.П,Тищенко и Э.Д.Джавадов (56) Авторское свидетельство СССР

N"1399934,,кл. G 01 N 33/48, 1988, (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕ3НИ

МАРЕКА

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано в птицеводстве.

Болезнь Марека кур — высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом герпеса группы В, характеризующееся развитием лимфоидных опухолей внутренних органов и лимфоидной инфильтрацией периферических нервов.

Известны способы диагностики болезни Марека на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических и гистологических изменений, результатов вирусологических исследований.

Клинико-эпизоотологическими проявлениями болезни Марека считают поражения периферической и центральной нервной системы птицы, сопровождающие. ся хромотой, парезами и параличами ног, крыльев, шеи, поражения кожи, проявляющиеся в виде утолщенных фолликулов перьев, диффузно опухолевидных утолщений кожи, частично с некрозами, поражения глаз в виде деформации зрачка с изменением цвета радужной оболочки или без такового. Однако появление этих признаков

„,!Щ„, 1791454 А1

s С 12 N 7/00, G 01 N 33/48 (57) Использование: ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: для оценки эпизоотической обстановки в птицехозяйствах от птицы берут из подкрыльцовои вены кровь и исследуют на наличие антител к основному белку миелина. Положительная реакция свидетельствует о заболевании болезнью Марека. зависит от степени поражения нервной системы.

Патологогистологические изменения при болезни Марека развиваются раньше, чем проявляются внешние симптомы болезни и характеризуются лимфоидно-клеточной инфильтрацией пораженных органов и тканей. В периферических нервах находят отечность, диффузно-очаговую лимфоидноклеточную инфильтрацию нервного ствола и его соединительнотканной оболочки, а также периаксональную демиелинизацию нервных волокон от которой зависит неврологическая симптоматика болезни.

Однако патологогистологические исследования трудоемки и, кроме того, требуют убоя птицы, что увеличивает стоимость диагностики.

Процедура вирусологического способа диагностики болезни Марека, включающая в себя биопробу на цыплятах, куриных эмбрионах и культуре клеток, выделение и идентификацию вируса, а также идентификацию антител у больной и переболевшей птицы посредством постановки реакции диффузной прецйпитации (РДП), длительна, требу1791454 положительной сыворотки, в две лунки — по

0,1 мл отрицательной сыворотки, в лунку, предназначенн,ю для контроля конъюгата, последовательно вносят все ингредиенты реакции, кроме сыворотки, вместо которой добавляют 0,1 мл промывочного буфера. В лунку, предназначенную для контроля субстрата взамен всех ингредиентов реакции, исключая субстрат, вносят по 0,1 мл промывочного буфера, субстрат вносят в таком же количестве. Внесенные в лунки исследуемые и контрольные пробы инкубируют 1,5 часа при 37 С. Затем панели промывают

4-5 и высушивают (п.1).

3. В лунки панели, эа исключением лунки "контроль субстрата" вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (специфические антитела (антивидовые), меченые пероксидазой), разведенного промывочным буфером до указанного рабочего разведения, который

20 связывается с антителами, Пробы инкубируют 1,5 часа при 37 С, По окончании инкубации панели промывают 4—

5 раз и высушивают.

25 жеприготовленного субстрата (0,8 мг/мл 5аминосалициловой кислоты с содержанием

0,005 Д перекиси водорода — рН 6,0-6,2).

Панель с пробами оставляют на 30 — 40 мин в темном месте, после чего учитывают результаты реакции.

Результаты учитывают спектрофотометрически при длине волны 450 нм, а при отсутствии .спектрофотометра — визуально.

При визуальной оценКе результатов окраску исследуемых проб сравнивают с окраской положительного и отрицательного стандартов.

Учет реакции проводят по 4-х крестовой системе:

++++ — темно-коричневое о кра ши ван ив;

+++ — коричневое окрашивание;

++ — светло-коричневое окрашивание;

+ - желтое окрашивание;

- — окрашивание отсутствует, Ответ считают положительным, если окраска раствора в лунке с исследуемым образцом соответствует н+" и выше.

3а титр сыворотки принимают максимальное ее разведение, которое еще обеспечивает окраску продукта пероксидаэной реакции на н+н в 2Л раза превышает экстинцию (оптическую плотность) раствора в лунках с отрицательной сывороткой.

Растворы в лунках с отрицательной сывороткой, "контроль субстрата "контроль конъюгата" должны быть неокрашены. Интенсивность окраски в лунке с положительй сывороткой должна соответствовать

+++", тавшиеся 6 лунок используют для но контроявй: в двв яункн вносят по О,! мя ет значительных затрат животных и материалов.

Известен способ диагностики ранних стадий болезни Марека кур, включающий введение в сережку внутрикожно основного белка миелина, считывание через 18-24 ч кожно-аллергической реакции, а также гистологическое подтверждение диагноза.

Однако данный способ диагностики сопряжен для птиц со стрессами, возникающими при неоднократном взятии их в руки, введении аллергена в сережку, а также при отреэании кусочков сережек для гистологических исследований.

Целью изобретения является уменьшение трудозатрат и снижение стрессового воздействия на птицу при прижизненной диагностике болезни Марека кур, повышение эффективности диагностики и улучшения,. за счет этого, эпизоотической обстановки в птицехозяйстве.

Это достигается тем, что для оценки эпиэоотической обстановки в птицехозяйсгее от птицы берут иэ подкрыльцовой вены

0,5 мл крови и исследуют на наличие антител к основному белку миелина, Положительнгя реакция свидетельствует о заболевании болезнью Марека.

Пример 1. При подозрении на болезнь

Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл. крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством проведения иммуноферментного анализа, включающего следующие этапы, 1, Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхности полистироловой панели. С этой целью в лунки 96-луночной панели вносят по 0,1 мл рабочего раствора основного белка миелина(в разведении 1;20), инкубируют в течение 2 часов при 37 С или 16 — 18 часов при 4 С.

После чего удаляют несорбированный основной белок миелина и лунки 4 — 5 раз промывают 0,01М фосфатно-буферным раствором (рН 7,2-7.4), содержащим 0,05 Д твина-20 и 0,5 М хлорида натрия. После каждой промывки перевернутые панели просушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

2. В каждую лунку вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 на промывочном буферном растворе. При этом антитела, находящиеся в пробах, связываются с антигеном (основным белком миелина), На исследование одной пробы используют две лунки, На одной 96-луночной панели можно исследовать 45 проб. Ос30

4, В лунки панели вносят по 0,1 мл све1791454

Пример 2. При подозрении на болезнь

Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее по месту флуоресцирующих антител, Исследование включает в себя три этапа.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на чистое. предварительно обезжиренное предметное стекло, не имеющее царапин, С этой целью наносят. по 3 капли (по 20 мкл каждая) "рабочего раствора" основного белка миелина в концентрации 1-2 мг/мл, разведенном на

0.01М фосфатно-буферном растворе (рН

7,2), приготовленном на 0.15М растворе хлорида натрия, На предметном стекле делают 3 мазка диаметром 1,0-1,5 см и высушивают их при комнатной температуре.

2. На каждый из мазков основного белка миелина наносят по капле исследуемой куриной сыворотки в разведении 1:4 на фосфатно-буферном растворе и помещают их во влажную камеру на 30 мин при 37 С, Затем мазки. дважды отмывают фосфатнобуферным раствором по 10 мин и подсуши. вают при комнатной температуре, 3. На подсушенные мазки наносят по 20 мкл коньюгата — коммерческого (производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН CCCP) антивидового гамма-глобулина, меченого ФФИТЦ, в рабочем разведении, указанном на этикетке.

Препараты инкубируют во влажной камере при 37 С в течение 30 мин, отмывают 3 раза по 5 мин фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и после подсушивания на воздухе просматривают под люминесцентным микроскопом с использованием нелюминисцирующего иммерсионного масла или диметилфталата. В микроскопе при этом используют-первичные фильтры типа СС-4, СС-8, С3С-7 в комбинации с запирающим светофильтром типа НС-18. Микроскопию окрашенных препаратов проводят в отраженных лучах, падающих на обьект, сверху, через объектив микроскопа.

Контролями специфичности при исследовании препаратов на наличие антител к основному белку миелина служат: — положительные препараты, обработанные нормальной сывороткой в различных разведениях; — положительные препараты, обработанные люминесцирующим антивидовым коньюгатом 683 иммунной немеченной сыворотки; — за специфическое принимают ярко-зеленое свечение миелиновых волокон в виде мелких гранул различной формы.

В контрольных препаратах специфиче5 ская зеленая флуоресценция должна полностью отсутствовать, Интенсивность специфического свечения в препарате оценивают по четырехбалльной системе:

10 ++++ — ярко изумрудно-зеленое свечение:

+++ — яркое зеленое свечение;

++ — слабое зеленое свечение:

+ — слабое зеленовато-желтое свечение.

15 Положительным результатом, свидетельствующим о заболевании болезнью Марека, считают наличие в препарате волокон основного белка миелйна с интенсивностью свечения 4 или 3 креста в 3-5 полях зрения, 20 П р и м е-р3. При подозрении на болезнь

Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством реакции агглю25 тинации латекса, включающей следующие этапы.

1, Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхность полистиролового латекса. С этой целью Ge30 рут 5 частей основного белка миелина s концентрации 16 мгlмл, разведенного глициновым буферным раствором (рН 8,8) и соединяют с 1 частью 10 отечественного карбоксилсодержащего полистиролового

35 латекса с диаметром частиц 0.8 мкм. Сенсибилизацию смеси "латекс-антиген" проводят в течение 2-х часов в термостате при

37 С.

По истечении этого срока сенсибилизи40 рованный латекс осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и ресуспендируют в этом же буферном растворе в виде 1 суспензии.

2. Исследуемые сыворотки прогревают

45 в течение 20 минут при 60 С или 30 минут при 56 С. Затем их разводят глициновым буферным раствором до рабочего разведения 1:4. Каплю (0,025 мл) разведенной сыворотки наносят на полистироловую

50 пластинку и к ней добавляют в равном объ-. еме суспензию сенсибилизированного латекса, Пластинку встряхивают вручную в течение 2 минут или на такой же срок помещают на вращательный столик. Реакцию

55 учитывают через 5 — 15 мин. При наличии в сыворотке гомологического иммунного ком, понента (антител к основному белку миелина) склеивающиеся частицы латекса образуют агглютинат, хорошо видимый невооруженным глазом. При отрицательных

1791454 результатах реакции суспензия латекса остается гомогенно мутной, без глыбок агглютината и участков просветления.

Учет реакции агглютинации латекса проводят по 3-х балльной системе:

+++- реэкоположительная реакция; четкая агглютинация, крупные хлопья в прозрачной жидкости;

++ — положительная реакция; четко ви димая агглютинация, однако фонд полностью не просветляется;

- — отрицательная реакция; жидкость остается гомогенно мутной.

Контролем реакции агглютинации латекса служат исследуемая куриная сыворотка в исходном разведении (1:4) + суспензия несинсибилиэированного латекса (отрицательная реакция); нормальная куриная сыворотка, не содержащая антител к основному белку миелина + суспензия сенсибилиэированного латекса, (проверка специфичности диагностикума); сыворотка от птицы с болезнью

Марека (гомологичная сыворотка) + суспензия сенсибилиэированного латекса (проверка активности диагностикума.

Пример 4, При подозрении на болезнь

Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством тонкослойного иммунного анализа, включающего следующие этапы.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхности полистирловой чашки Петри диаметром 40 мм, предварительно обработанной этанолом. Для этого на поверхность чашки вносят

2 мл рабочего раствора основного белка миелина в концентрации 1 — 4 мг/мл, приготовленного на калий-фосфатном буферном растворе (рН 7,2 — 7,4), Антиген инкубируют при 37 С в течение 1 часа или при 4ОС.—

16-18 часов. После чего удаляют избыток антигена, а поверхность чашек 2-3 раза промывают калий-фосфатным буферным раствором и высушивают при комнатной температуре. При этом один и тот же раствор антигена можно использовать 4-6 раз.

Сенсибилизированные чашки Петри хранят до использования во влажной камере при

40 С.

2. На сенсибилизированную основным белком миелина поверхность чашки вносят по 0,025 мл исследуемых сывороток в разведении 1:4 на калий-фосфатном буферном растворе, На каждой из двух крышек чашки Петри можно исследовать 20-30 проб (каждая проба обводится шариковой ручкой), 5

fl р и м е р 5.

1, По п,1 примера 3

20

Использование предложенного в каче45 стве изобретения способа прижизненной диагностики болезни Марека кур позволяет

3, Высушеннуючашкуустанавливают на

1 мин в перевернутом виде над водяной баней с температурой воды 56ОС, Результаты реакции учитывают визуально, оценивая характер образующегося конденсата, Конденсат, образующийся на участках, покрытых комплексами антигенантитело имеет вид крупных капель диаметром 2-4 мм, а на необработанных участках и на обработанных нормальной или даже иммунной сывороткой — мелких капель диаметром 0,5-1,0 мм.

2. На поверхность чашки Петри вносят

2 — 3 мл расплавленного 1% агара (темп, 5056 С), приготовленного на 0,15 M растворе хлорида натрия с добавлением 1 лошадиной сыворотки, После застывания агара в нем пробойником вырезают лунки диаметром 3 — 4 мм в которые вносят исследуемые сыворотки и контрольные сыворотки (нормальную сыворотку и сыворотку от птицы, больной болезнью Марека) по 0,025 мл в каждую лунку. Чашку оставляют на 24 часа при комнатной температуре для диффузии сывороток, после чего агар удаляют, чашку промывают калий-фосфатным буферным раствором.

3, Высушеннуючашкуустанавливают на

1 мин в перевернутом виде над водяной баней с температурой воды 56 С.

Результаты реакции оценивают визуально по характеру образующегося конденсата или по диаметру зоны крупнокабельного конденсата, т.к. эти величины прямо пропорциональны концентрации антител в исследуемом материале, Например, при содержании в исследуемой жидкости 1/4 мкг/мл антител диаметр соответствующей зоны составлял 4 мм, при 22 мкг/мл — 8 мм, 87,5 мгкlмл — 12 мм оперативно, до развития клинико-эпизоотологических признаков, проводить диагностику заболевания. При этом отпадает необходимость в проведении диагностики по способу, основанному на считывании кожно-аллергической реакции, который изза неполного выявления больной птицы применим только для групповой диагностики, снижаются трудозатраты на осуществлеwe диагностики и стрессовое воздействие на птицу. За счет указанного выше повышается эффективность диагностики и улучшается эпизоотическая обстановка в птицехоэяйстве, 10

1791454

Составитель И. Тищенко

Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева

Редактор С. Кулакова

Заказ 134 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ диагностики болезни Марека путем постановки иммунологической пробы на миелин, отл и чаю щи йся тем, что,с целью упрощения и ускорения способа, в качестве иммунологической пробы используют определение антител к основному белку миелина в сыворотке крови.