Способ определения проницаемости мембраны нервной клетки

 

Использование: медицина, экспериментальная биология, оценка эффективности биологически активных веществ, исследование клеточных мембран. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: радиоактивный аналог исследуемого вещества подводят к тестируемой клетке попеременно с намеченным изотопами исследуемым веществом так, что радиоизотопы присутствуют в окружающей клетку среде только в периоды времени, соотвествующие строго определенной фазе генерации потенциалов действия.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ E СКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4745933/14 (22) 13.09.89 (46) 23,01,93. Бюл, ¹ 3 (76) Л.В.Бобровников (56) Епифанова О.И„Терских В.В., Захаров

А.Ф. Радиоавтография, М„Высшая школа, 1977, с.42. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ НЕРВНОЙ КЛЕТКИ (57) Использование; медицина, экспериментальная биология, оценка эффективности

Изобретение относится к биологии, а именно к методам количественной оценки показателей метаболизма возбудимых клеточных элементов в период их функциональной активности.

Цель изобретения — повышение точности способа, Способ осуществляется следующим образом. Находящиеся в составе препарата или в изолированном состоянии функционально активные нервные клетки помещают в проточную камеру, обеспечивающую непрерывную смену физиологического раствора. С помощью микроманипулятора к исследуемому нейрону под визуальным контролем подводят регистрирующий микроэлектрод, сигнал с которого подают на вход усилителя биопотенциалов, Погружение микроэлектрода заканчивают после появления на выходе усилителя характерных высокоамплитудных импульсов, соответствующих разрядам клетки, С помощью другого микроманипулятора к этому же нейрону подводят закрепленный на пьезокерамическом элементе

„„Я2„„1790768 АЗ биологически активных веществ, исследование клеточных мембран. Цель изобретения — повышение точности способа, Сущность изобретения; радиоактивный аналог исследуемого вещества подводят к тестируемой клетке попеременно с намеченным изотопами исследуемым веществом так, что радиоизотопы присутствуют в окружающей клетку среде только в периоды времени, соотвествующие строго определенной фазе генерации потенциалов действия, микрокатетер, из которого под давлением подается радиоактивно меченное вещество, Подключенный к выходу усилителя биопотенциалов (через преобразователь уровня сигнала) пьезоэлемент устанавливают таким образом, чтобы выходящая из катетера микроструя была направлена на плазматическую мембрану регистрируемой нервной клетки только в период генерации потенциала действия, т.е. только во время механической деформации пьезоэлемента, вызываемой соответствующим электрическим импульсом. В межимпульсные интервалы времени траектория микроструи проходит минуя область локализации тестируемого нейрона, и происходит отмывка изотопов общим протоком физиологического раствора. Цикл подведения и отмывания изотопа проводят многократно. Затем клеточную ткань фиксируют и авторадиографически определяют количество поглощенного исследуемой клеткой радиоактивно меченного вещества.

Пример. Проводилось определение проницаемости для одной из аминокислот (лейцина) плазматической мембраны фоно1790768 инкубации каждой клетки. Были получены следующие результаты.

Данные по основной серии (подведение импульсной метки)

Количество исследованных клеток 20

Количество зерен восстановленного серебра 14,7 + 0,42

Дисперсия 1,87

Коэффициент вариации среднего значения 12,7;4 клеток в 10,7 раза

135,35!

Составитель Л. Бобравников

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор З.Салко

Редактор

Заказ 375 Тираж Подписное

BHÈÈÏÈ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 воактивных нейронов париетального ганглия (П.Па 1) виноградной улитки в период генерации потенциалов действия. Полуинтактный препарат моллюска помещали в ванночку для злектрофизиологических исследований. Скорость протока раствора Рингера составляла 5 мл/мин, Содержащий

ЗН-лейцин раствор (1 млКюри/мл) подавали со скоростью 0,2 мл/мин из катетера диаметром 0,3 мм. Электрическую активность нейрона отводили экстраклеточным способом. В качестве"регистрирующего электрода испольэовали стеклянные микропипетки (диаметр кончика 1 мкй}, заполненные 2,5 M раствором натрия хлорида. Подведение микроэлектрода и установленного на пьезоэлементе катетера осуществляли с помощью манипуляторов марки MM-1 под контролем микроскопа МБС-2. У каждой исследуемой клетки регистрировали 6000 потенциалов действия, что соответствовало

1,5 — 2-часовому периоду ее инкубации. Продолжительность подведения импульсной изотопной метки во время отдельного спайка составляла IQ мс. Длительность общего периода пооведения равнялась 1 мин.

После завершения тестирования нервную ткань замораживали в изопентане, охлажденном жидким азотом до-70 С, а затем на 12 ч помещали в абсолютный этиловый спирт (Т =-40 С), Срезы толщиной 10 мкм монтировали на предметных стеклах, которые после этого покрывали тонким слоем фотоэмульсии типа Р, Время экспозиции всех радиоавтографов составляло 3 недели.

При проявке использовали проявитель Д19, а в качестве фиксажа — 30%-ный раствор гипосульфита. Количество поглощенного за

1 мин изотопа оценивали путем подсчета количества зерен восстановленного серебра над контуром исследуемой клетки. При статистической обработке данных использовали критерий Стьюдента, Полученные результаты сопоставляли с контрольными определениями, когда биоэлектрическая активность у нейронов не регистрировалась, а подведение ЗН-лейцина той же концентрации и удельной радиоактивности осуществлялось непрерывно на протяжении 1 мин

Данные по контрольной серии (по прототипу)

Количество исследованных клеток 20

Количество зерен восстановленного серебра 6,45 - 2,0

Дисперсия 8,73

Коэффициент вариации среднего значения 135,35

Различия величин дисперсии и коэффициентов вариации статистически достоверны (р < 0,001).

Таким образом, как показывают полученные результаты, предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет повысить точность определения проницаемости плазматической мембраны нервных

Формула изобретения

Способ определения проницаемости мембраны нервной клетки, включающий инкубацию исследуемой клетки в среде, содержащей радиоактивно меченное соединение, удаление изотопа, фиксацию клетки и авторадиографическую оценку количества поглощенного клеткой соединения, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, к клетке дополнительно подводят микроэлектрод, регистрирующий разрядную активность, при наличии потенциала действия подводят изотоп, отмывают его в межимпульсном интервале, при этом цикл подведения и отмывания изотопа проводят многократно.