Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови

 

Использование: медицина, а именно при исследовании биологических жидкостей может быть использовано в лабораторной диагностике. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа разделения фракций уробилина в сыворотке крови. Сущность изобретения: на фильтр из бумаги для электрофореза диаметром 25-30 мм, пропитанный в течёте 10-15 мин 0,5 мл сыворотки крови, наносят 0,01 мл азотной кислоты жёлтого цвета от присутствия азотистой и по появлению в месте нанесения азотной кислоты бирюзовой окраски в первую минуту - судят о присутствии D-фракции, по появлению только пурпурной и фиолетовой окраски - 1-фракции, по появлению желтой - L-уробилина (стеркобилина), по появлению окрасок: бирюзовой, за ней кольца пурпурно-фиолетовой, с последующим развитием желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций.

СОК)3 СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.(st)5 G 01 N 33/72

Г 1НОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДО СТВО СССР (ГОСП ТЕНТ СССР)

О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4 74817/14 (22) 1 .02.89 (46) 0,02.93. Бюл. ¹ 5 (71) ижегородскйй медицинский институт им..М. Кирова и Институт йрикладной физики Н СССР (72) .М. Горский и К.В, Ильичева (56) вторское свидетельство СССР

N 826245, кл. G 01 N 33/72. (54) ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ

УРО ИЛИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) спользование: медицина, э именно при исследовании биологических жидкостей может быть использовано в лабораторн и диагностике, Цель изобретения— упр щение и ускорение способа разделезобретение относится к медицине, а име но к исследованиям биологических жид остей путем разделения фракуробилина,и может быть использовано в лабораторной диагностике. роблема разделения фракций уробилин традиционного трудная. До настоящего ремени нет экспрессного и простого мет да разделения фракций.

К наиболее надежным и точным методам относят методы электрофореза с последук)щей обработкой лент хлорным железом или хлоридом ртути. Методы требуют специальной аппаратуры и занимают 48 ч рабочего в ремени.

Существует простой метод индикации, но ыделяется одна фракция и требует специального аппаратурного обеспечения, I

Существует метод индикации 1-уробилинэ в моче, Метод осуществляется путем дл тельного приготовления импрегнирова ных особым составом лент, с его помо цью может быть осуществлена !

БЦ,, 1793378 Al ния фракций уробилина в сыворотке крови.

Сущность изобретения: на фильтр иэ бумаги для электрофореза диаметром 25-30 мм, пропитанный в течение 10-15 мин 0,5 мл сыворотки крови, наносят 0,01 мл азотной кислоты желтого цвета от присутствия азотистой и по появлению в месте нанесения азотной кислоты бирюзовой окраски в первую минуту -- судят о присутствии D-фракции, по появлению только пурпурной и фиолетовой окраски — 1-фракции, по появлению желтой — L-уробилина (стеркобилина), по- появлению окрасок: бирюзовой, за ней кольца пурпурно-фиолетовой, с последующим развитием желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций. индикация фракции только 1-уробилина и только в моче, За прототип предлагаемого изобретения взят способ, основанный на реакции окисления фракций уробилина хлорным железом. Он позволяет разделить фракции и, особенно, выделить фракцию О-уробилина, которая, как установлено авторами, несет особую информацию для цели дифференциальной диагностики, в то время как содержание ее MBRQ, и это самая неустойчивая иэ всех фракций. Этим вызвана некоторая ее недооценка в клинической практике. К основным недостаткам метода следует отнести следующие: метод требует предварительного осаждения билирубина с последующей длительной -экстракцией фракций хлороформом, его выпаривание; время реакции 2,5-3 ч; регистрация результатов требует специальной аппаратуры (спектрофотометр); для выполнения анализа требуется специалист средней или высшей квалификации, 1793378

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается следующим способом: на фильтр из бумаги для электрофореза диаметром 25 — 30 мм, пропитанный 0,5 мл сыворотки крови в течение

10-15 мин, наносится 0,01 мм азотной кислоты желтого цвета от присутствия азотистой и по йоявлению на месте нанесения кйслот бирюзовой окраски в первую минуту судят о присутствии.D-фракции, йо появлению только пурпурной и фиолетовой окраски — 1-уробилина, по появлению желтой— -уробилина (стеркобилина), при развитии окрасок: бирюзовая, за ней — кольцо пурпур- 15 ной или фиолетовой с последующим появлением желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций.

Если на пропитанную биологической жидкостью фйльтровальную бумагу{круг диа- 20 метром 25-30 мм) нанести 0,01 мл азотной кислоты с присутствием азотистой, в пер-. цые же 30 с на фильтре появляются концентрические кольца различной окраски.

Авторы данной заявки впервые путем па- 25

" раллельно проведенного спектрального анализа устайовили, что каждому кольцу оп- . ределенной окраски соответствует опреде ленная фракция уробилина или стеркобилина;....: — 30

Первой в реакцию окисления вступает фракция О-уробилина, как самая неустойчивая. и дает кольцо-пятно лазурного цвета, соответствующее глаукобилину — конечному продукту окисления фракции, если она 35 присутствует в субстрате. Второй в реакцию вступает l-уробилин, если он присутствует, и дает концентрическое кольцо пурпурно-сиреневого, фиолетового цвета, соответствующее виолинам. Кольца не смешиваются,. 40 т.к. на такой"бумаге идет постоянный форез от-центра к периферии, Последним — через

1-2 мин в центре развивается желтое пятйо . — это стеркобилин; он не мигрирует, оставаясь в центре. При отсутствии первых двух 45 фракций имеет место только желтое пятно стеркобйлина с белым концентрическим кольцом вокруг. В сыворотке крови — это коагулироваваий белок.

При высоком уровне I-уробилина на 8- 50

10 мин реакции во внешнем круге появляется бирюзовый или лазурный цвет — это глаукобилин, полученный из виолинов при избытке окислителя или самого субстрата, На 15 — 20 мин может появиться сине-голу- 55 бая окраска — это продукт окисления свободного билирубина. Чтобы этого избежать,, авторами подобраны обьем сыворотки, окислителя и диаметр фильтра. Для правильной оценки фракционного состава по хроматограмме важно расшифровать ее в первые 5 — 6 мин. Первым в реакцию вступает 1-уробилин. Появление лазурной окраски во внешнем кольце после пурпурно-фиолетовой не свидетельствует о присутствии этой фракции, а характеризует высокий уровень I-уробилина.

Ранее подобная реакция использовалась в лабораторной диагностике при исследовании мочи на билирубин — проба

Гмелина (Руководство по клиническим и лабораторным исследованиям. Медицина, M., 1960, стр.375). Возможность индикации фракций уробилина и стеркобилина с помощью этой реакцйи нигде не описана, что доказывает соответствие предлагаемого способа критерию "существенные отличия".

Способ осуществляется следующим образом: в центре фильтра непроклеенной бумаги диаметром 25 — 30 мм на столике с уровнем (для равномерного пропитывания), находящимся в чашке Петри и предварительно смоченном дистиллированной водой; наносят 0,5 мл сыворотки крови.

Фильтр пропитывается ею 10 — 15 минут, после чего оставшаяся, не впитавшаяся сыворотка крови, стряхивается о стенку чашки, пропитавшийся таким образам фильтр помещается на стекло (на столике с уровнем) в центр наносится капля азотной кислоты желтого цвета от присутствия азотистой, объем капли равен 0,01 мл. Азотная кислота в качестве окислителя вместо РеС!з взята, как наиболее сильный и практически бесцветный окислитель, Объем сыворотки, окислителя и диаметр фильтра подобраны экспериментально. Ниже приводятся результаты этих эксперимвнтов. Для анализа выбрана непроклеенная бумага для электрофореза с характеристиками; масса 1 кв.м

245+.15 г, толщина 44М мкм, капиллярная всасываемость при поперечном направлении 80+7 мм, впитываемость при погружении менее 2 с. Все характеристики приведены для воды. Приходится учитывать, что при анализе сыворотки крови, содержащей крупные молекулы биологических соединений, в частности пигменты — это целые цепи молекул "упакованные в особые упаковки", чтобы бумага пропитывалась максимально, выбрано время 10 — 15 мин. По истечении этого времени объем остаточной капли варьировал в пределах 0,02 — 0,15 мл, что зависело от состава сыворотки. При времени, меньшем 10 мин, разброс остаточной капли значительно больше (0,05-0.2).

Объем 0,01 м НЙОз определен путем вычисления, т.к. допустимый уровень содержания фракций известен.

1793378 вует ческ

1,37 рац мал сост до 9 нео ко ц

15 при отц

16м суж нии про круг зом уже фил

30

40 исс ным

4 центр пропитанной таким образом бум ги наносится капля азотнои кислоты жел ого цвета от присутствия в ней азотисто и по появлению в ней концентрических кол ц последовательно: бирюзового, всех

on нков фиолетового, желтого (в центре) се вместе или какой-то одной окраски судят присутствии всех вместе или какой-то одн и фракции. ,Пример конкретного исполнения.

1. Больной Калягин Т.Г., 50лет, ист. б-ни

¹ 1РОО, Диагноз: хронический персистирующ6й гепатит. У больного из сыворотки кро50

55 каст цен

Это ми, мак

D-y ветс

Есл то и мож ем, аме сле что ноо аэт то ч ист но, онцентрация 9-8,5 МНЙОз соответстконцентрированной кислоте. Коммерая кислота имеет плотность

1,405 г/см и соответственно концентю 61-68%, пределы колебаний норностей при такой характеристике вляют 8,95-8.52. Авторы округлили это

8.5. Концентрация азотистой кислоты ределяется, поэтому указывается тольет (желтая от присутствия азотистой).

ыбранный объем окислителя 0,01 мл, анесении его на фильтр, форезировал нтра на радиус 8 мм (диаметр круга до

) за 5 мин, на 6 мин этот круг начинал ться; улетучивалась вода, При нанесеэтого же обьема кислоты на фильтр, итанный дистиллированной, диаметр достигал 22 мм, о отдельных случаях . Так как объем и концентрация были выбраны, то авторы остановились на тре с диаметром 25-30 мм. ри выборе объема исследуемой жид1 авторы исходили из следующего; конрация фракций уробилина очень низка. подтверждается имеющимися даннымл сыворотки крови о патологии могут имально содер>кать 17,2 мкг фракции обилина, минимально — 5,2 мкг. Соотоенно в 0,5 мл — 1,72 мкг и 0,52 мкг. взять объем сыворотки меньше 0,5 мп, ри низкой концентрации фракции, ее

<о не уловить. Если брать больший объо соответственно следует увеличить дир фильтра, обьем окислителя, а овательно.и время реакции. Учитывая (э 6 — 7-ой минутах в реакцию вступают е пигменты — билирубин; биливердин, дополнительно новые цветные кольца, ение фореграммы с целью выделения нных уробилинов(и D) будет затруднеохранение же Диаметра фильтра и объокислителя при увеличении обьема ротки крови приведен только к увелию объема невпитавшейся сыворотки. ак авторы стремились сократить объем едуемой жидкости, то выбрали его рав0 5+0 05 мл. ви, взятой в биохимическую лабораторию для планового лабораторного обследования, взяли 0,5 мл сыворотки крови, пипеткой нанесли ее на фильтр, находящийся на горизонтальном уровне, смоченный дистиллированной водой, Фильтр пропитывался 10 мин, Невпитавшуюся сыворотку крови стряхивают о край, фильтр в строго горизонтальном положенйи (по уровню) помещают на стекло, в центр наносят 0,01 мл окислителя.

По истечению 1 мин в центре появился ровный желтый круг с белвы ареолом (коагулировавший белок); 5 мин — картина та же, но ярче, 10 мин — картина таже. Т.е. в данной пробе сыворотки крови фракции 1- и 0-отсутствуют, а есть только стеркобилин (физиологическая норма). Спектральный анализ этой же пробы дал результат: стеркобилин

100%; I уробилин 0%; 0-уробилин 0%.

2. Больная Киселева Т,П., 58 лет, ист. б-ни ¹ 1162. Диагноз: вирусный гепатит. Из сыворотки крови больной, взятой для планового лабораторного обследования взяли 0,5 мл сыворотки, пипеткой нанесли на фильтр, смоченный дистиллированной водой, находящийся в чашке Петри на горизонтальном уровне. Фильтр пропитывается 10 мин, невпитавшуюся сыворотку крови стряхивают о край чашки, фильтр в строго горизонтальном положении (по уровню) помещают на стекло, в центр его наносят 0,01 мл окислителя, и в первые же секунды появляется розовое пятно (мезобилиродин), второе коп ьцо фиолетовое (мезобиливиолин), через

1 мин в центре желтое пятно, вйешне кольЦо фиолетовое; 3 мин — та же картина, но ярче, на 5-ай минуте картина сглаживается, но появляется кольцо билирубина (общего}. У данной больной вирусный гепатит, для которого характерно повышенное содержание

l-уробилинэ, который в процессе окисления дэл кольцо мезобилиродина и мезобиливиолина, и повышенное содержание стеркобилина (желтое пятно). Данные спектрального анализа; стеркобилин 45%; 1-уробилин 55%;

0-уробилин 0%.

3. Больной Бусыгин И.Ф., 66 лет, ист. б-ни ¹ 1245. Диагноз: первичная В(печени, В процессе планового лабораторного обследования взято из вены 2 мл крови, путем центрифугирования получена сыворотка крови и 0,5 мл ее нанесены на фильтр, смоченный дистиллированной водой, расположенный в чашке Петри на строго горизонтальной поверхности, через 10 мин невпитавшаяся сыворотка стряхивается о край чашки, фильтр помещается на стекло. расположенное на горизонтальной поверхности и в центр фильтра вводится 0,01 мл окислителя, В первые секунды появляется

1793378

Формула изобретения

Сравнительная таблица прототипа и предлагаемого метода разделения фракций

1,- I-, 0-уробилина

Методический прием

Предлагаемый мета

Прототип

1. Забор крови

2. Получение сыворотки крови

3. Исследуемый объем пробы

4, Исследование в пробирке

5, Исследование на бумажном фильтре

6, Осаждение билирубина

7, Центрифугирование осадка

8. Забор цантрифугата а Лалиталанулг во, : Да

Да

0,5 мл

Да

Нет

Нет

Нет

Да

Да

5мл

Да

Да

Да

Да бирюзовая окраска, к 30 с она становится лазурно-бирюзовой (глаукобилин), 1 мин— окраска еще ярче, а круг больше, на 2-ой минуте появляется фиолетовое кольцо (мезобиливиолин), а в центре желтое пятно. К 5

5-ой минуте преобладает круг лазури с бирюзовой, узкое кольцо фиолетового цвета и в центре небольшое желтое пятно. У больного преобладает фракция D-уробилина (продукт его окисления — глаукобилин). Зна-. 10 чительно меньше фракции I-уробилин (присутствие мезобиливиолина), желтое пятно— стеркобилин, Результат спектрального анализа: стеркобилин 25%; I-уробилин 27%; Dуробилин 48% 15

Таким образом, в трех сыворотках крови предложенным способом разделены фракции уробилина. в первом только стеркобилин, во втором — 1-уробилин и стеркобилин и в третьем все три фракции — I, 20

D-уробилин и стеркобилин, С помощью описанного способа проведения меэобиливиолиновой реакции на бумажном фильтре обследована сыворотка крови.

В группы обследуемых вошли: 25 доноры 20, больные 125.

Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови, включающий проведение мезобиливиолиновой реакции, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, берут бумажный фильтр диаметром 25-30 мм, который пропитывают в течение 10-15 мин сывороткой крови в объеме 0,5 мл с последующим нанеПолучены следующие результаты: у 20 доноров из 20 на фильтре развивалось только желтое пятно, в тех же образцах сыворотки крови методом спектральной оценки мезобиливиолиновой реакции в 20 случаях зафиксировано 100% содержание стеркобилина. У больных в 55 случаях развивались красно-фиолетовое кольцо v желтое пятно, что свидетельствует о присутствии 1-уробилина и стеркобилина, В тех же случаях спектральный анализ показал присутствие

I-фракции и стеркобилина, их процентное соотношейие колебалось в разных пределах. У 50 больных на фильтре зафиксировано от центра и периферйи желтое пятно, изумрудно-голубое, красное, фиолетовое. что говорит о присутствии фракций I-, D- u стеркобилина. Их соотношение, как правило, по данным спектрального анализа составило по 30 — 35 процентов. Y 20 больных в первые же секунды на фильтре развивалась изумрудно-голубая окраска, затем она растекалась кольцом вокруг желтого пятна, что говорило о присутствии фракции D-уробилина и стеркобилина. Спектральный анализ показал их разное процентное соотношение. сением в центр фильтра 0,01 мл концентрированной азотной кислоты с примесью азотистой кислоты и при появлении в течение первой минуты бирюзовой окраски судят о присутствии D-уробилина, желтой — L-уробилина, пурпурной и фиолетовой — 1-уробилина, а при последовательном появлении бирюзовой, пурпурной, фиолетовой и желтой окрасок судят о присутствии всех трех фракций уробилина.

1793378

Продолженйе таблицы

Составитель Т, Малютина

Ре актор Т. Никольская . Техред М.Моргентал Корректор H. Слободяник

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Заказ 502 Тираж .. . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4!5