Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы sau 6782

 

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: клетки Staphylococcus aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптического гидролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифугированием . Бактериальную массу суспендируют в рабочем буфере рН 7,4, содержащем 10 мМ К-фосфат, 7 мМ ft -меркаптоэтанол и 1 мМ ЭДТА, добавляют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20°С. Затем клеточную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс.д в течение 1 ч. Нэдбсадочная жидкость представляет собой грубый экстракт. Освобождают от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина. Высаливание белков проводят сульфатом аммония (СА) 80% насыщения. Осадок растворяют в рабочем буфере рН 9, диализуют от СА и наносят на колонку с ФЦ-Р11, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10 мл/ч. Колонку промывают тремя объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 М и снижающихся значений рН от 9 до 6. При этих условиях R sau 6782 элюируется узким пиком в области 0,4- 0,45 М NaCI, а неспецифические нуклеазы элюируются близкими концентрациями NaC 0,45-0,55 М. Полученный препарат R sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических примесей. Выход фермента составляет 1300ед. из 1 г. биомассы . Активность - 2500 ед./мл. Удельная активность - 60000 ед./мг. 2 ил. ел С 4 Ю О о 4 О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)з С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 4920752/13, (22) 20.03.91 (46) 23;02.93. Бюл, М 7 (71) Институт биологической и медицинской химии и Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) И,И.Никольская-Санович, Е.Е.Арутюнян, Н.А.ГонЧао, И.М.Губер и И.Я.Левченко (56) Sussenbach; J.S,, Monfort С.H., Schlphof

R,, Stoberlngh E.Å. А restriction endonuclease . from staphylococcus. aureus, — 1976, Nucl. асЫз Res, — 3, 3193 -3202, Арутюнян E.Å., Грубер И.M., Поляченко

В;М. и др. Рестриктирующая эндонуклеаза за0 6782. — Вопр. мед. химии, 1985, N 6, с.

127-132. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕС РИКТИРУЮЩЕЙ ЭНДОНУКЛЕАЗ61 SAU 6782 (57) Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: клетки

Staphylococcus aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптического гидролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифуги: рованием. Бактериальную массу суспендируют в рабочем буфере рН 7,4, содержащем

10 мМ К-фосфат, 7 мМ Р-меркаптоэтанол и

Изобретение относится к микробиоло гии и генной инженерии и касается способа получения рестриктирующей эндонуклеаэы (R) Sau 6782, которая может быть использо вана в молекулярно-биологических и генетических экспериментах по изучению структуры и функций ДНК, а также в генной Ж 1796676 А1

1 мМ ЭДТА, добавляют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20 С. Затем клеточную суспензи о подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс,g в течение 1 ч. Надосадочная жидкость представляет собой грубый экстракт. Освобождают от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина. Высаливание белков проводят сульфатом аммония (СА) 80% насыщения. Осадок растворяют в рабочем буфере рН 9, диализуют от СА и наносят на колонку с ФЦ-Р11, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10 мл/ч, Колонку промывают тремя объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейся концентрации

NaCl от 0,0 до 1,0 M и снижающихся значений рН от 9 до 6. При этих условиях R sau y

6782 элюируется узким пиком в области 0,40,45 М NaCI, а неспецифические нуклеаэь1 элюируются близкими концентрациями а йаС! 0,45-0,55 M. Полученный препарат R

sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических примесей; Выход а фермента составляет 1300 ед, из 1 r. биомассы. Активность — 2500 ед./мл. Удельная ак- 0 тивность — 60000 ед,/мг, 2 ил. (, с инженерии для конструкгирования рекомбинантных молекул.

Целью изобретения является упрощение способа, сокращение продолжительности процесса и повышение выхода целевого продукта.

1796676

3 4

Поставленная цель достигается тем, что элюируется узким пиком в области 0,4-0.45 в способе получения рестриктазы Sau 6782 M NaCI, a неспецифические нуклеазы —. катионообменную хроматографию на фос- близкими концентрациями йаС1 0,45-0.55 фоцеллюлоэе РИ осуществляют непосредст- M (фиг 1, пример 1), венно после высаливания белков с 5 - ПолученныйпрепаратК$аи6782содериспользованием двойного комбинирован- жит незначительное количество неспецифиного градиента повышающейся концентра- ческих примесей, Выход фермента ции хлористого натрия от 0,0 до 1,0 М и составляет1300 ЕД из 1 r биомассы. Активснижающихся значений рН от 9 до 6. " ность — 250 ЕД/мл. Удельная активность

За единицу активности препаратов ре- "0 60000 ед/мг. ". стриктаэы принимают количество мкл фер- . П р и. м е р 2. Культивирование клеток, мента, вызывающих полный гидролиз 1 мкг их разрушение, получение грубого экстракДНК фага А за 1 ч инкубации при 37 C. та, освобождение от нуклеиновых кислот и

Реакцию рестрикций проводят в инку- высаливание белков ведут, как в примере 1, бационной смеси обьемом 30 MKII следую- "5 Осадок растворяют в рабочем буфере рН 8 щего состава: 0,06 М трис-HCI рН 7,5, 0,015 до конечной концентрации 2 мг/мл, диали- .

M Mg CIz 0 06 М NaCI; 7 мМ р -меркаптоэта- зуют против РБ и наносят на колонку 1,2х10 нала, 1 ЕД рестриктазы, 1 мкг ДНК фага iL с м M с c Ф LЦ(, уравновешенную тем же буфером

Рестриктазную активность тестируют со скоростью 10 мл/ч. Колонку промывают при горизонтальном электрофорезе в 1 / 20 тремя объемами буфера и фермент элюируагарозном геле. Гель окрашивают раство- ютдвойным комбинированным градиентом ром этидия бромида в концентрации 3 повышающейся концентрации NaCI от 0,0 мкгlмл 20 мин и фотографируют в ультрафи- до I,Î М и снижающихся значений рН от 8 олетовом свете при 254 нМ с красным све- до 7. При этих условиях рестриктаза элюитофильтром, .. 25 руется 0,,4 — 0;5 МйаС! и отделяется отнеспеУдельная активность выражается s цифических нуклеаз, обнаруживаемых в единицах активности на 1 мг белка. Кон- зоне 0,55 — 0,65 М NaCI с хорошим разреше, центрацию белка определяют спектрофото-. нием, метрически, Полученйый таким способом препарат

Примеры конкретного осуществления 30 R Sau 6782 полностью свободен от неспециспособа. фических примесей и пригоден для любых

П р и м е.р 1. Клетки S/aureus 6782 - видов структурных исследований. Выход культивируют в ферментере на среде, при- фермента 1500 ЕД на 1 r биомассы, Удельготовленной на основе триптического гид- ная активность 70000 ЕД/мг. Активность ролизата казвина и дрожжевой воды, и 35 3000 ЕД/мл. осаждают центрифугированием. Бактери- Пример 3. Все этапы вплоть до альную массу суспендируют в рабочем бу- хроматографическойочистки, как в примере фере (РБ) рН 7,4, содержащем 10 мМ:1. Ферменты элюируют градиентом повыК-фосфат, 7 мМ р -меркаптоэтанол и 1 мМ шающейся концентрации NaCI от 0,0 до 1,0

ЭДТА, добавляют лиэостафин и инкубируют 40 М и понижающихся значений рН ат 7,5 до 7, 20 мин при 20ОC. Полученную клеточную При этих условиях рестриктаза элюируется суспенэию подвергают ультразвуковой дез- 0,40-0,55 M NaCI, а неспецифические нукинтеграции и центрифугируют при 105 тыс. леазы -0;50-0,65 М NaCI. Следовательно, в

g 1 ч.Надвсадочная жидкость представляет. условиях более пологого градиента пики собой грубый экстракт. Освобождение от 45 оказываются размытыми и эффективного нуклеиновых кислот осуществляют с по- разделения ферментов не происходит, В мощью сульфата стрептомицина. Высалива- . препарате R Sau 6782 содержатся примеси ние белков проводят сульфатом аммония нуклеаз. Выход фермента 1200 ед/г, Актив{СА) 80% насыщения, Осадок оастворяют в ность 2000 ед/мл. Удельная активность

РБ рН 9 до конечной концентрации 2 мг/мл, 50 55000 ед/мг. диалиэуют от CA и наносят на колонку Для стандартной процедуры выделения

1,2х10 см с ФЦ, уравновешенную тем же фермента был выбран пример 2. буфером со скоростью 10 мл/ч. Колонку про- Доказательства высокой степени чистомывают тремя объемами РБ и элюируют ты ферментного препарата получены при фермент двойным комбинированным гра- 55 использовании современныхтестов(фиг.2). диентом повышающейся концентрации Тестирование экзонуклеазных примеNaCi от 0,0 до 1;0 М и снижающихся значе- сеи осуществлялось по степени лигирований рН от 9 до 6. Объем градиента 80 мл, ния фрагментов рестрикции. Полученные в собираемой фракции 4 мл. Рестриктаза результате гидролиза А Sau 6782 фрагменты

ДНК фага Ллигировались ДНК-лигазой фа1?96676

Характеристика препарата R Sau 6782 га Т4 с эффективностью более 90 . Однако абсолютные доказательства отсутствия следовых количеств зкзонуклеаз в препарате R

Sau 6782 получены при инкубации 14-членного синтетического меченого 32Р олиго- 5 нуклеотида (ОНД); не имеющего сайта . узнавания для исследуемого фермента, с Й

Sau 6782. При инкубации ОНД с R в течение

18 ч на радиоавтограмме была получена лишь исходная полоса, что свидетельствует 10 об исчерпывающем освобождении фермента от сопутствующих экзонуклеаз, Тестирование неспецифических зндонуклеазных примесей проводили путем длительной в течение 36 ч инкубации ДНК фага 15

Л с избытком ферментного препарата. Различий со стандартной картиной гидролиза не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии неспецифических зндонуклеаз в препарате фермента. 20

Полученный таким способом препарат

R Sau 6782 полностью свободен от неспецифических примесей и пригоден для любых видов структурных исследований. Выход фермента 1500 ЕД на 1 r биомассы. Удель- 25 ная активность 70 тыс. ед/мг белка. Активность 3 тыс. ЕД/мл, Препаратхранится при

-20 С в течение 3 лет без потери активности.

Сравнение показателей ферментного препарата и Яао 6782, полученных по пред- 30 лагаемому способу и прототипу, представлено в таблице. Как видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет увеличить выход и активность R Sau 6782 в 1,5 раза, а также повысить его стабильность при хранении. Кроме того, предлагаемый способ более простой и технологичный и требует меньше времени для реализации, Формула и зоб рете н и я

Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы Sau 6782, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма Staphylococcus aureus 6782, обработку бактериальной массы лизостафином. ультразвуковую дезинтеграцию, удаление нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония, катионообменную хроматографию на фосфоцеллюлозе Р!1, о т л ича ющийся тем,что,с целью упрощения способа, сокращения продолжительности процесса и повышения выхода целевого продукта, катионообменную хроматографию на фосфоцеллюлозе Р И осуществляют непосредственно после высаливания белков с использованием двойного комбинированного градиента повышающейся концентрации хлористого натрия от 0,0 до 1,0 M и снижающихся значений рН от S,Î до 6.0.

1796676

oooo

io

Пример 2.

ОООО

goo

Пример 3.

tone

soo

179667b

1 . Тестирование примесей неспецифических нуклеаэ в препарате R .Хь|о782.

Ф

< а/ Лигирсвание фрагме 1тов p ñòðèêöèè /злектрофорез в агарозе/

I трек- фХ фага /конт1оль/ . 2 трек- фрагменты ДЫ -;.ага госле гидролиза Я 5 5782.

3 трек- лиировзние фрагментов рсстрикц..и ДИ-лигазой фага Т. ° б/ Чест с синтстлческим ме4еннм слигонуклеотидом. трек- l4-членннй интетический мечень Й . ОНД /RQH.p0Jlb/ з

2 трек- С -Д после инкубаци с И.Ьб Лс2 в течение IB часов.

Составитель И. Никольская-Санович

Редактор О. Стенина Техред М. Моргентал Корректор О, Густи

Заказ 632 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям пли ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101