Способ получения гиалуронидазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к микробиологической промышленности , и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовления лекарственных средств. Цель изобретения - повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы. Способ заключается в том, что штамм Streptomyces actinocidus 77 выращивают глубинным способом, фильтрат культуральной жидкости подкисляют до рН 4,4-4,6, осветляют и сорбируют на карбоксильном катионите КМ-2п. Сорбент промывают и гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем при перемешивании и уголь отделяют. Удельная активность продукта 60 МЕ/мг, степень очистки 30. 2 з.п. ф-лы, 5.табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4784556/13 (22) 19.01.90 (46) 30.03.92. Бюл. ЛЬ 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) T.Ï.Óâàðêèíà, Г,А.Молодова, В,И,Максимов, Т,А,Матюшина,,,А.Данилова, Л.К.Шатаева, Н.Г.Жукова, А,И.Зорина и

С.Ю. Ожерелье в (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 974816, кл. С 12- N 9/14, 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической проИзобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовления лекарственных средств.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ, в котором продуцент гиалуронидазы — штамм Streptomyces

actinocidus 77 — выращивали глубинным способом, культуральную жидкость концентрировали вакуум-выпариванием при 4060 С и рН 7,5 — 8,5, фермент выделяли осаждением из культуральной жидкости 3 — 4 объемами этилового спирта. В результате получали препарат гиалуронидазы с активностью 450 — 800 МЕ/г (колоримерический метод) и удельной активностью 7 — 10 МЕ/мг белка.

<щ Жди 1723121 А1 мышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов для приготовления лекарственных средств, Цель изобретения— повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы. Способ заключается в том, что штамм Streptomyces actinocidus 77 выращивают глубинным способом, фильтрат культуральной жидкости подкисляют до рН

4,4 — 4,6, осветляют и сорбируют на карбоксильном катионите КМ-2п. Сорбент промывают и гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем при перемешивании и уголь отделяют. Удельная активность продукта 60 МЕ/мг, степень очистки 30. 2 з, и. ф-л ы, 5 табл.

Недостатками данного технического решения являются низкая активность и степень чистоты гиалуронидазы. и

Цель изобретения — повышение активности и степени чистоты гиалуронидазы.

Штамм Streptomyces actinocidus 77 выращивают глубинным способом на питательююЬ ной среде определенного состава, фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2N соляной кислотой до рН 4,4 — 4,6, осветляют центрифугированием или фильтрацией и сорбируют на карбоксильном катионите

КМ-2п (40 — 60 объемов на объем сорбента) со скоростью 50 — 100 мл/ч/см, сорбент

2 промывают 0,01 M ацетатным буфером р Н 4,4 — 4,6, гиалуронидазу десорбируют щелочными растворами, затем элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0 — 1,5% при перемешивании и уголь отделяют. Десорбцию можно прово1723121 дить либо в статических условиях при рН

8,5 — 8,7, либо в динамике растворами щелочи, аммиака или раствором фосфорнокислого натрия двузамещенного.

Втабл,,1 представлены данные по подбору условий сорбции гиалуронидазы из 1 л фильтрата культуральной жидкости на колонке с карбоксильным катионитом KM-2п объемом 20 мл (Ф = 1,1 см, I = 5 см). Для сравнения приведены данные по сорбции гиалуронидазы на колонке тех же размеров с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и некоторых других карбоксильных катионитах.

Из табл. 1 следует, что из пяти испытанных карбоксильных катионитов только КМ2п практически полностью сорбировал гиалуронидазу. Сорбцию фильтрата культуральной жидкости на катионите необходимо проводить в интервале рН 4;4 — 4,6, при этом на стадии подкисления гиалуронидазная активность сохраняется на 60 — 70, при снижении рН до 4,2 гиалуронидаза инактивируется сильнее и активность сохраняется лишь на 50 . При увеличении рН до 4,8 количество фермента в "проскоке" достигает 15, что уменьшает выход фермента, Важное значение имеет скорость сорбции фильтрата культуральной жидкости на катионите. Оптимальным является интервал 50 — 100 мл/ч/см, При уменьшении ског рости ферментный раствор при кислых значениях рН (4,5) длительное время сорбируется на колонку, что приводит к снижению стабильности гиалуронидазы, В результате увеличения скорости сорбции пропорционально повышается выход фермента в

"проскоке" и соответственно снижается количество гиалуронидазы в элюате.

Гиалуронидазу десорбируют различными щелочными растворами в статических условиях в воду путем сдвига рН или в динамических условиях путем пропускания различных элюентов через колонку с сорбентом, Данные по подбору условий десорбции приведены в табл. 2 (сорбцию фермента проводили в оптимальных условиях; рН 4,5, скорость 70 мл/ч/см ).

Из табл. 2 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических условиях необходимо проводить при рН выше 8,5, при этом выход на стадии составлял 55 — 607, . Увеличение рН выше 8,8 приводило к элюции большого количества балластных белков, что вызывало уменьшение удельной активности в конечных препаратах (CM. табл. 5), В табл. 3 приведены экспериментальные данные по подбору условий обесцвечивания растворов гиалуронидазы активированным углем.

10

Результаты опытов свидетельствуют о том, что при концентрации угля 1,0 — 1,5 происходит обесцвечивание раствора гиалуронидазы на 75-78 при сохранении активности на стадии до 85 — 90, При снижении концентрации угля в растворе остается значительное количество пигментов, что отрицательно влияет на качество препаратов. Увеличение концентрации угля до

2,0 приводит к снижению выхода гиалуронидазы на стадии обесцвечивания, Схема получения гиалуронидазы по предлагаемому способу представлена в табл. 4.

Как видно из табл. 4, предлагаемая схема позволяет получить гиалуронидазу высокой степени очистки с удельной активностью 60 МЕ/мг белка и общим выходом фермента 35, 20 Пример (по прототипу), Продуцент гиалуронидазы Streptomyces actinocidus 77 выращивали в ферментере емкостью 250 л (заполнение 180 л) на среде, содержащей

3 / гидролизата БВК, 0,8 сульфата аммо25 ния. 0,1 / KgHP04. Аэрация в процессе культивирования дробная: первые 12 ч роста — 9 м /ч, затем до конца культивирования 27 м /ч, рН в начале культивирования 6,8, время выращивания 56 ч, По окончании

30 выращивания мицелий отделяют центрифугированием, фильтрат культуральной жидкости (150 л) упаривали в 10 раз. К концентрату добавляли 4 объема охлажденного этилового спирта, осадок отделяли на

35 нутч-фильтре и лиофилизировали. Получали препарат гиалуронидазы с активностью 450

МЕ/г и удельной активностью 8 МЕ/мг белка, Пример 1. Продуцент гиалуронидазы

40 выращивали на той же питательной среде, в теж же условиях, что и в примере по прототипу, мицелий отделяли центрифугированием, Получали 150 л фильтрата культуральной жидкости с активностью 13 МЕ/мл и удель45 ной активностью 2,0 ME/мг белка, Фильтрат подкисляли 2N соляной кислотой до рН

4,5 и сорбировали на колонку (d = 12 см,! =

28 cM) с 3,0 л карбоксильного катионита КМ2п кислотного гидролиза (биокарб К), урав50 новешенного 0,01 М ацетатным буфером рН

4,5. Скорость сорбции — 70 мл/ч/см, время г сорбции 19 ч. Катионит после сорбции переносили в емкость с мешалкой, дважды (по 3 л) отмывали 0,01 М ацетатным буфером рН

55 4,5, Гиалуронидазу десорбировали с катионита в статических условиях 7,5 л дистиллированной воды путем доведения рН до значения 8,7 раствором 2 М едкого натрия, Перемешивали смесь 15 мин, элюат отфильтровывали через капроновую ткань, затем

1723121

Таблица 1 проводили повторную десорбцию фермента в тех же условиях. Элюаты объединяли. Выход активности на стадии сорбции-десорбции составил 397,, активность 55 МЕ/мл. К

15 л элюата добавляли 150 г активированного угля марки Б и перемешивали 30 мин.

Уголь отделяли центрифугированием при

5000 об/мин 30 мин. Ферментный раствор упаривали под вакуумом при 30 С до активности в растворе 130 МЕ/мл. Получили 3,5 л раствора, общий выход на стадии 92 .

Удельная активность 60 МЕ/мг белка, общий выход на схеме 39 Д, степень очистки

30 раз.

Пример 2. Стадии получения и очистки гиалуронидазы до стадии десорбции проводили аналогично примеру 1. Десорбцию с катионита проводили непосредственно на колонке в динамических условиях, используя 0,2 М раствор Na2Hi 04 Элюирование производили со скоростью 14 мл/ч/см .

Фракции с гиалуронидазой объединяли, Объем элюата — 30 л, рН вЂ” 7,5. Выход активности на стадии сорбции — десорбции составил 38, Активность 28 МЕ/мл. К 30 л элюата добавили 360 г активированного угля, перемешивали 30 мин и уголь отделяли.

Ферментный раствор обессоливали и концентрировалии ул ьтрафил ьтрацией. Объем полученного концентрата 5,2 л, активность

131 МЕ!мл, Удельная активность 70 МЕ/мг белка, общий выход 34 Д, степень очистки

35.

Пример ы 3 — 10, Продуцент гиалуронидазы выращивали как в примере 1, мицелий отделяли центрифугированием, Условия сорбции и десорбции представлены в табл. 5, Из табл. 5 следует, что десорбцию гиалуронидазы в статических условиях необходимо проводить при рН 8,5-8,8, при этом выход фермента составляет 31-35, а удельная активность достигается 49 — 60

МЕ/мг белка (примеры 4 — 6). Увеличение рН при десорбции больше 9,0 приводит к зна5 чительному снижению удельной активности в препарате. Наилучшие результаты по десорбции гиалуронидазы в динамике получены при использовании 0,2 M раствора форсфорнокислого натрия двузамещенно10 го, при этом удельная активность достигает

70 МЕ/мг белка (пример 10). Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать фермент с высокой степенью очистки. По сравнению с примером-прототипом удель15 ная активность гиалуронидазы выше в 7 — 9 раз (примеры 4, 10).

Формула изобретения

1. Способ получения гиалуронидазы.

20 предусматривающий глубинное выращивание продуцента Streptomyces actinocidus

77, отделение мицелия; выделение фермента из полученной культуральной жидкости и очистку,отличающийся тем,что,с

25 целью повышения активности и степени чистоты гиалуронидазы, культуральную жидкость подкисляют до рН 4,4-4,6, а очистку фермента ведут сорбцией через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2п кислот30 ного гиуролиза со скоростью 50 — 100 мл/ч/см и десорбцией с катионита щелочными растворами, полученный элюат обесцвечивают активированным углем в концентрации 1,0 — 1,5, при перемешива35 нии.

2, Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент десорбируют с катионита в статических условиях при рН 8,5-8,8.

3. Способ по п.1, отличающийся

40 тем, что фермент десорбируют промыванием катионита в колонке 0,2 М МагНРО4.

1723121

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

1723121

Табли ца 5

Стадии

Пример

ll0

Очистки

Обесцвечивание углем,В

Сорбции

pl l скорост ь млlч см2

В статике

1,2

8,7

1,0

31

1,2

100

8,8

1,5

1,2

9,0

В динамике

4,5

5,0-10,0 1,2 (24 р-р аммиака) 70

30

4,5

5,0-c)0 1,2

0,2 Мр-р

МаОН) 10

5,5-7,5 1,2

0,2Ир р

П а1:РО

4,5

33

45

Составитель Т.Уваркина

Техред М,Моргентал Корректор В.Гирняк

Редактор Н,Горват

Заказ 1042 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

3 4,4

4 4,5

5 4,4 ь 4,ь

4,4 т

Десорбция, рИ

Выход гиалуронидазы, 4

Удельная активность

ИЕ/мг белка

48

52