Способ получения биомассы sтrертомyсеs, обогащенной эндонуклеазой рестрикции sfi i.

 

Изобретение относится к области микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Streptomyces fimbnatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I, и увеличение выхода целевого фермента. Способ заключается в следующем. Колонии микроорганизма Streptomyces fimbriatus (ВКПМ S 750), выросшие на твердой питательной среде, гомогенизируют и переносят в жидкую питательную среду, состоящую из 3.5-3,7% гидролизата кильки. Выход биомасы составляет 18-20 г/л культуральной жидкости , выход рестриктазы Sfi I 1000 ед/г 5 табл . 1 ил. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 C 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4735184/13 (22) 05.09.89 (46) 30.12.91. Бюл. № 48 (71) Институт цитологии и генетики СО АН

СССР и Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.Е.Репин, Т.К.Малуп, А,А.Николаенкова, Н.И,Речкунова, С,M.Ñâèðèäîâ и С.Х.Дегтярев (53) 677. 15.07(088.8) (56) Журавлева Л.И., Орешкин Е.Н,. Безбородов А.М. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Sac I из Streptomyces

achromogenes АТСС 12767. — Прикладная биохимия и микробиология, 1987, т.23. N 2, с.208 — 215, Орехов А.В., Ребентиш Б.А„Дебабов

В.Г, Новая сайт-специфическая эндонуклеаза из Streptomyces-Sgr II — Доклады АН

СССР, 1982, т.263, ¹ 1, с.217 — 220.

Изобретение относится к микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Streptomyces fimbriatus c высоким содержанием рестриктазы Sfl I.

Зндонуклеазы рестрикции являются важными инструментами генетической инженерии. Рестриктаза Sfi 1, выделенная из

Streptomyces fimbriatus S-750, является уникальным ферментом, способным узнавать и расщеплять октануклеотидную палиндромную последовательность с варьируемым участком вставки 5 -GGCCN4N GGCC-3 .

Способы получения рестриктаз различаются между собой используемыми штаммами, условиями культивирования, стадиями очистки. Оптими.зация каждой, ... Ы„, 1701745 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ

STREPT0MYCES, ОБОГАЩЕННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ РЕСТРИКЦИИ SFI I (57) Изобретение относится к области микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Streptomyces fimbriatus с высоким содержанием рестриктазы Sfi I, и увеличение выхода целевого фермента.

Способ заключается в следующем. Колонии микроорганизма Streptomyces flmbriatus (ВКПМ S-750), выросшие на твердой питательной среде, гомогенизируют и переносят в жидкую питательную среду. состоящую из

3,5-3,7% гидролизата кильки. Выход биомасы составляет 18 — 20 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Sfi I 1000 ед/г. 5 табл., 1 ил. стадии позволяет увеличить выход целевого

С) продукта, однако решающего значения можно достигнуть, целенаправленно влияя на биосинтез рестриктазы, изменяя условия Ь культивирования. Ql

В литературе сведений о получении биомассы Streptomyces fimbriatus, обогащенееюеЬ ной эндонуклеазой рестрикции Sfi I, не обнаоужено.

Известен способ получения биомассы микроорганизмов вида Streptomyces

achromogenes АТСС12767, включающий в себя культивирование в колбах на среде следующего состава. г/л: глюкоза 10,0; пептон 4,0; дрожжевой экстракт 4,0; MgSO4>

i7Н О 0,5; К2НРО4 4,0; КН Р04 2.0 (среда S) 1701745. на круговых качалках(200 об/мин) при 30 С, рН среды 7,0-7.1; культивирование продолжали 24 ч. Выход биомассы 6,65 г/л.

Недостатком способа является сложный состав питательной среды, низкий выход биомассы и невозможность, используя штамм, получить эндонуклеазу рестрикции

Sfi l.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы из

Streptomyces grisens, включающий культивирование продуцента на питательной сре: де S при температуре 30 С в колбах в течение 15 ч при перемешивании. Клетки центрифугировали и хранили при 20 С, Выход биомассы составляет 8,2 г/л культуральной жидкости. Выход рестри ктазы ) gr l l 20 едlг мицелия, Основными недостатками прототипа являются: невысокий выход биомассы; низкий выход целевого фермента; многокомпонентная сложная питательная среда; невозможность данным способом получить, фермент, узнающий и расщепляющий поI следовательность нуклеотидов 5 -GGCCNs66СС-3 .

Целью изобретения является повышение выхода биомассы и увеличентле выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что инокулят продуцента фермента, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, подвергают гомогенизации перед культивированием, а культивирование биомассы Streptomyces fimbriatus ведут на йитательной среде, содержащей гидролизат кильки в количестве 3,5 — 3,7, в течение 48—

53 ч при перемешивании, которое в течение первых двух суток осуществляют со скоростью 200 — 220 об/мин, а начиная со вторых суток — 150 об/мин.

Способ заключается в следующем.

Колонии микроорганизма Streptomyces

fimbriatus (ВКПМ S-750), выросшие на твердой питательной среде, переносят (из расчета .8 — 10 колоний на 1 л жидкой питательной среды) в стеклянный гомогенизатор. Колонии тщательно ресуспендируют до образования гомогенной массы, после чего переносят в жидкую питательную среду, состоящую из 3,5-,7 гидролиэата кильки, Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30 С в течение 48 — 53 ч при перемешивании. при этом в течение первых суток (24 ч) перемешивание осуществляют со скоростью 200-220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) — со скоростью

150 об/мин.

После 53 ч культивирования клетки центрифугируют и выделяют из биомассы рестриктазу Sfi! известным способом (табл.1), Выход биомассы составляет 18-20 г/л кул ьтурал ь ной жидкости. В ы ход рестриктазы Sfi! составляет 1000 ед. акт./r. Удельная

5 активность рестриктазы Sfi I составляет

3000 ед/мл.

Получаемая рестриктаза Sfi I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5-GGCCNa 66СС-3, свободна от неспе10 цифического нуклеазного загрязнения и пригодна для использования в генноинженерных работах, Определяющими отличительными признаками способа являются следующие.

15 1, Инокулят продуцента фермента, содержащий 8 — 10 колоний микроорганизмов на 1 л питательной среды, подвергают гомогенизации, что позволяет повысить выход биомассы.

20 Особенностью Streptomyces fimhriatus является то, что колонии этого микроорганизма представляют собой сферические образования в форме шариков. Поэтому небходимо перед высевом в жидкую пита25 тельную среду провести тщательную их гомогенизацию, что дает возможность получать гомогенную биомассу. состоящую из колоний размером 1.5 2 0 мм. с высоким выходом.

30 В случае отсутствия предварительной гомогенизации биомасса представляет собой крупные клеточные конгломераты диаметром 5 — 8 мм и единичные мелкие колонии диаметром до 1,0 мм, что затрудняет выде35 ление фермента.

Зависимость выхода и качества биомассы от дозы посевного материала и режима обработки представлена в табл.2.

Из табл,2 видно, что оптимальным режи40 мом для получения биомассы Streptomyces

fimhnatus является использование посевной дозы 8 — 10 колоний субстратного мицелия на

1 л свежей питательной среды и последующая гомогенизация инокулята.

45 При использовании посевной дозы менее 8 колоний на 1 л выход биомассы падает. а при использовании более 10 колоний на 1 л дальнейшее повышение выхода не происходит, однако наблюдается неравномерное

50 разрушение биомассы.

2. Культивирование продуцента веду на питательной среде. содержащей 3,53,7 гидролизата кильки в качестве органического источника аминного азота и

55 незаменимых аминокислот. что позволяет повысить выход биомассы и целевого фермента.

В табл,3 представлена зависимость выхода биомассы и фермента от состава питательной среды.

1701745

5 I0

20

Иэ табл.3 видно, что использование гидролизата кильки в экспериментально подобранной оптимальной концентрации (3,5-3,7 ) способствует максимальному накоплению рестриктазной активности, эа счет чего повышается выход целевого фермента.

При использовании питательной среды с запредельными значениями концентраций гидролизата кильки (меньше 3,5 и больше 3,7 ) выход биомассы и фермента снижается.

3. Культивирование продуцента ведут в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) перемешивание осуществляют со скоростью 200—

220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) — со скоростью 50 об/мин, что позволяет повысить выход биомасы и целевого фермента.

В табл.4 — 5 приведены зависимости выхода биомассы и фермента от времени культивирования и скорости перемешивания гомогенной биомассы.

Из табл,4 и 5 видно, что увеличение урожая клеток в первой фазе культивирования(24 ч) происходит при перемешивании со скоростью 200 — 220 об/мин, что связано с эффективным разрушением клеточных ассоциаций, а уменьшение скорости перемешивания до 150 об!мин во второй фазе роста (после 24 ч) способствует увеличению гомогенной биомассы, обогащенной рестри ктазой, На чертеже представлены электрофореграммы продуктов гидролиза линеаризованной по Vsp! — сайту плазмиды pDKR 85 ферментом Sfi I, где:

1 дорожка — ДНК pDKR85

2 дорожка — обработка ферментом 15 мин

3 дорожка — —" 30 мин

4 дорожка — — -- 45 мин

5 дорожка — — — 1 ч

Как видно из чертежа при культивировании бактерии Streptomyces fimbriatus предлагаемым способом получают рестриктазу Sfi i, специфически гидролиэующую субстрат, не имеющую побочных интерферирующих активностей, Пример 1, Клетки выращивают на твердой питательной среде(СПА). 9 колоний стерильно помещают в стеклянный гомогенизатор и тщательно ресуспендируют, однородную суспензию добавляют в 1 л питательной среды, состоящей из 3,6% гидролизата кильки. Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30 С с перемешиванием 210 об/мин в течение 24 ч, далее 150 об/мин. После 50 ч культивиро25

55 вания клетки центрифугируют. Выход биомассы 20 г/л. Биомассу хранят при -70 С.

20 г клеток суспендируют в 80 мл буфера

А (0,01М калий-фосфатный буфер, pHG 7,5, 10 M P-меркаптоэтанол, 10 М ЗДТА, 10 M фенилметилосульфонилфторид) и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С) и надосадочную жидкостьнаносят на 250 мл

ДЕАК-сефарозы 6В (Pharmacia), уравновешенной буфером А, затем колонку промывают буфером А до ичезновения

УФ-поглощающего материалал в элюате.

Несвязавшийся с колонкой белок высаливали добавлением сульфата аммония до

70 насыщения и собирали центрифугированием(10000 об/мин. 20 мин при 4 С). Осадок растворяли в 0 мл буфера А содержащего 0,15М NaCI,äèàëèçîaàëè против буфера А, содержащего 0,15М NaCI e течение 16 ч и наносили на 50 мл гепаринсефарозы (Pharmacia). Колонку промывали буфером А, содержащим 0,15М NaCI до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, затем буфером А, содержащим 0.14 M

NaCI и 0,01 tween 20 (Serva), до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. затем фермент элюировали буфером А, содержащим 1 M КаС!. Белок в смыве высаливали добавлением сульфата аммония л 70 насыщения и собирали центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин при 4 С). Осадок белка растворяли в 5 мл буфера А. содержащего 0,15М NaCI, диализовали против буфера А, содержащего 0,15M NaCI, в течение 16 ч, наносили на 15 мл гепарин-сефарозы, уравновешенной буфером А, содержащим

0,15M NaCI, и злюировали 150 мл градиентом 0,5 — 1,5 M NaCI в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликвоты иэ каждой фракции(1 мкл) инкубировали 1 ч при 50 С с 1 мкг ДНК фага Т7 и анализировали в геле агарозы. Реакции, расщепляющие ДНК фага Т7 (21 — 29), объединяли, диализировали 3 ч против 2 л буфера А, содержащего 0,15М

NaCl. наносили на 20 мл HTP — biogeI (BIoRad) и элюировали 400 мл градиентом (буфер А, содержащий 0,15М NaCI. буфер А. содержащий 0,5М калий-фосфат и 0,15М

NaCI). Объем фракций 10 мл. Фракции, содержащие Sfi I, определяли так же, как при хроматографии на гепарин-сефарозе, Фракции 29 — 32 объединяли и диализовали против буфера, содержащего 001М трис-HCI, рН 7,5, 0,2М КС1, 0,1мМ ЭДТА. 1мМ дитиотрептол, 50 глицерин.

За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходи1701745

Табли ца1

Белок, мг

Степень Удельная активность

Стадии очистки

Активность, ед.акт. очистки ед/мл ед/мг

Грубый лизат

450

100.000

1000

222

Очистка на ДЕАЕ-сефарозе

80.000

1,600

230

Сульфат-аммонийное осаждение и очистка (ступенчатая элюция) на гепарин-сефарозе

60.000

22 5 1000

3.000

Сульфат-аммонийное осаждение и очистка (градиентная хроматография) на гепарин-сефарозе

225 800

900 750

17.500

60.000

2 35.000

0,5 30.000

Очистка от нтр-bioge1

П р и м е ч а н и е. Активность объединенной фракции до диализа против

50/ глицерина. Удельная активность целевого продукта составляет 3.000 ед/мл или 60.000 ед/мг

Мое для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pDKR85 в течение 1 ч при 50 С.

Ферментный препарат хранят при

-20 С, Из1 гбиомассы получают1000ед. рестрикта- 5 зы Sfl! с удельной активностью 3000 ед/мл.

Пример 2. Подготовку инокулята и культивирование ведут аналогично примеру

1, кроме того, что берут 10 колоний на 1 л 10 середы, состоящей из 3,7% гидролизата кильки. Перемешивание осуществляют при 220 б/мин в течение первых 24 ч, далее 150 б/мин. Клетки собирают после 53 ч. Выход иомассы 20 r/ë. Выход фермента составляет 15

1000 ед/г, удельная активность 3000 ед/мл, Пример 3, Подготовку инокулята и культивирование ведут так же, как в приме в 1, кроме того, что берут 8 колоний на 1 л 20 вежей питательной среды на основе 3,5% идролизата кильки. Перемешивание в перой фазе осуществляют со скоростью 200

6/мин. Клетки собирают после 48 ч. Выход биомассы 18 г/л. Выход фермента 1000 25 ед/г, активность 3000 ед/мл.

Формула изобретения

Способ получения биомассы

Streptomyces, обогащенной эндонуклеазой рестрикции Sfi I, включающий подготовку инокулята, культивирование продуцента фермента на жидкой питательной среде, содержащей органический источник азота, углерода, минеральные соли и воду при 30 С с перемешиванием и последующим отделением биомассы от культуральной жидкости, отличающийся тем. что, с целью повышения выхода биомассы и увеличения выхода целевого фермента, в качестве микроорганизмов берут штамм

Streptomyces fimbriatus ВКПМ S=750, используют инокулят, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, который перед культивированием подвергают гомогенизации, культивирование продуцента ведут нэ питательной среде, содержащей в качестве источника азота, углерода и минеральных солей гидролизат кильки в количестве 3,5 — 3,7%. в течение 48-53 ч при перемешивании. осуществляемом в течение первых суток со скоростью 200 — 220 об/мин. а начиная с вторых суток — 150 об/мин.

1701745

Та бли ца2

Доза посевного материала (количество колоний на l л среды) Режим обработки

Характеристика биомассы (диаметр клеток, мм) Выход Примечание биомас" .сы,г/л

Плохо подвергаются дезинтеграции

8-10

Без обработки.3-5

Крупные конгломера-. ты (диаметр 5-8) 8-10

18-20

Колонии мелкие выровненные (1,5-2) Гомог енизация перети" раннем в стеклянном гомогенизаторе

То же

Равномерное разрушение клеток при дезинтеграции

8-9 То же

Колонии мелкие .выровненные (1,52,0)

Колонии различаются по размерам (от 1,5-2 до 3-4) 18-20

Разрушение биомассы неравномерное

13-15

Таблица 3

Выход биоВыход фермента, ед.акт/г массы, г/л

Не тестируется

Не тестируется

Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г 15

NaC1 10 r

0,1ж КИО,, 0,05< К,НРО, О, 054 NaC1, О, 001 Fe SO 7Н О 10

О, 0023 СаСОЗ, О, 05 ь МдЯО, ° .Н О

2ь глюкоза, 0,014 аланин, 10 мг/мл и-аминобензойная кислота, 0,024 дрожжевой экстракт, 0,054 гидролизат

Гидролизат кильки, 4

3,5

3,7

4,0

Не тестируется

200 фоновая активность

s-среда

Сос та в пита тельной среды

Сердечно-мозговая вытяжка (Difco) L-среда (триптон (Difco) 10 r

12

18

16

Присутст-. вуют крупные и мелкие колонии

1701745

Та блица 4

Выход рестриктазы ед.лкт/г

Время культивирования, ч фоновая активность

800

24

48

53

Таблица5

Число обоЧисло обо- Выход ротов пос- биомасле 24 ч сы, г/л об/мин

Относительный выход фермента, ротов первые 24 ч, об/мин

8

16

18

250

150

Не тестируется

46

Некондиционная биомасса

51

Много мелких колоний наряду с

2,0 мм

Некондиционная биомасса

160

200

18

220

Составитель Л. Кучумова

Редактор Т,Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор C. ×eðíè

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 4512 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5