Способ выделения пектолитических ферментов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении пектолитических ферментов. Цель изобретения - увеличение выхода пектолитических ферментов с одновременным выделением .протеолитических ферментов. Изобретение заключается в том, что добавление сульфата аммония в раствор, вспенивание и отбор пены осуществляют многократно, при этом для выделения протеолитических ферментов вспенивание и отбор пены осуществляют при изменении степени насыщения с 0,1 до 0.6'с шагом 0.1 и изменении рН раствора с 2.5 до 8.5 или с 8,5 до 2.5 с шагом 0.5^ после чего осуществляют выделение гтектолитинеских ферментов многократным вспениванием и отбором пены при изменении степени насыщения с 0.6 до 1,0 с шагом 0.1 и изменении рН раствора с 2.5 до 5,5 или с 5.5 до 2.5 с шагом 0.5. Выход пектолитических ферментов увеличен на 46%. 1 табл.^

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 9/ 00, 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

М»

»О (21) 4809438/13 (22) 30.01.90 (46) 15.02.92. Бюл. М 6 (71) Научно-производственное обьединение

"Биотехника" (72) Б.А.Величко, Г,В.Черкасова, Л.А.Шутова и Т.В.Полянская (53) 577.15 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

N- 535345, кл. С 12 N 9/14, 1975.

Авторское свидетельство СССР

N 516740, кл. С 12 N 9/00, 1973. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении пектолитических ферментов. Цель изобретения — увелйчение выхода пектолиИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения пектолитических ферментов.

Известен способ получения пектолитических ферментных препаратов из растворов согласно которому проводят подкисленйе раствора до рН 2,0 — 3,0, смешивание его с органическим растворителем до рН смеси 3 5 — 4,0 для преимущественного осаждения пектинэстеразы, при этом в жидкую фазу вводят стабилизатор и затем смешивают ее с органическим растворителем до достижения рН смеси 4,5-6;0 и полученный осадок, преимущественно содержащий полигалактуроназу, отделяют от жидкости.

Известен также способ выделения ферментов, в том числе пектолитических из.

„„Я2„„1712414 А1 тических ферментов с одновременным выделением .протеолитических ферментов.

Изобретение заключается в том, что добавление сульфата аммония в раствор, вспенивание и отбор пены осуществляют многократно, при этом для выделения протеолитических ферментов вспенивание и отбор пены осуществляют при изменении степени насыщения с 0,1 до 0,6»с шагом 0,1 и изменении рН раствора с 2,5 до 8,5 или с 8,5 до 2,5 с шагом 0,5, после чего осуществляют выделение пектолитических ферментов многократным вспениванием и отбором пены при изменении степени насыщения с 0,6 до 1,0 с шагом 0,1 и изменении рН раствора с 2,5 до 5,5 или с 5,5 до 2,5 с шагом 0,5.

Выход пектолитических ферментов увеличен на 46ф,. 1 табл. жидких растворов, включающий введение в

° юшй раствор сульфата аммония; вспенивание раствора путем пропуска через него воздуха, сбора и концентрирования пены, Ь

Недостатком указанных способов является неполное выделение целевых фермен-,фь тов. (Цель изобретения — увеличение выхода пектолитических ферментов с одновременным выделением протеолитических ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что введение сульфата аммония, вспенивание и отбор пены ведут многократно, при этом сульфат аммония добавляют с шагом 0,1 до достижения степени насыщения, величину. рН раствора доводят до 8,5 и от 8.5 до 2.5 с

1712414 шагом 0,5 и выделяют из раствора протео- шагом 0,5, Затем добавляют сульфат аммолитическиеферменты,послечегокоставше- ния до степени насыщения 0,9, раствор муся раствору добавляют сульфат аммония вспенивают, пену отбирают. Процесс вспе.с шагом 0,1додостижения степени насыще- нивания и отбор проб осуществляют многония и изменяют величину рН раствора до 5 кратно при изменении рН до5,5с шагом 0,5.

5,5, а затем снижают до 2,5 с шагом 0,5 и После этого добавляют сульфат аммония до выделяют пектолитические ферменты, при степени насыщения 1,0, раствор вспениваэтом вспенивание и отбор пены проводят ют, пену отбирают. Процесс вспенивания и после каждого изменения показателя насы- отбор пены осуществляют многократно при щения и величины рН. 10 изменении рН до 2,5 с шагом 0,5. ОтобранПредлагаемый способ осуществляется ные фракции пены при степени насыщения . следующим образом. 0,7 — 1,0 объединяют в одну для получения

В исходный раствор вводят сульфат ам- пектолитических ферментов, мания до степени насыщения 0,1, рН рас- Целесообразно процесс выделения твора доводят до 2,5, вспенивают путем 15 протеолитических ферментов с целью освоподачи воздуха через раствор и отбирают бождения пектолитических производить в пену. После отбора пены рН раствора дово- интервале рН от 2,5 до 8,5, так как при этом дятдо3,0. Раствор вспенивают. Пену отби- происходит выделение множественных рают. Процесс вспенивания и отбор пены форм протеолитических ферментов, име- . осуществляют многократно при изменении 20 ющих различн,ые изоэлектрические точрН раствора до 8,5 с шагом 0,5. Затем до- ки, а процесс выделения пектолитических бавляют сульфат аммония до степени насы- ферментов при рН 2,5 — 5,5, так как изощения 0,2. Раствор вспенивают, пену электрические точки различных форм отбирают. Далее процесс вспенивания и от- пектолитических ферментов находятся в бор пены осуществляют многократно при 25 этом пределе. изменении рН до 2,5 с шагом 0,5. Сульфат Выделение пектолитическихферментов аммония добавляют до степени насыщения в интервале рН до 8,5 существенно не уве0,3. Раствор вспейивают, пену отбирают. личивает выхода ферментов, Процесс вспенивания и отбор пены осуще- Выделение ферментов следует провоствляют многократно при изменении рН до 30 дить при константе насыщения от 0,1 до 1,0, 8,5 с шагом 0,5, Затем добавляют сульфат так как при константе насыщения от 0,1 до аммония до степени насыщения 0,4. Рас- О,бвыделяютсяразличныеформыпротеоли,твор вспенивают, пену отбирают. Процесс тических ферментов, а при константе насывспенивания и отбор проб осуществляют щения от 0,7 до 1,0 происходит выделение многократно при изменении рН до 2,5 с 35 различных форм пектолитических ферменшагом 0,5 и добавляют сульфат аммония до тов, имеющих молекулярные массы меньше, степени насыщения 0,5. Раствор вспенива- чем протеолитические, ют. Пену отбирают. Процесс вспенивания и При проведении процесса выделения отбор проб осуществляют многократно при при константах насыщения от 0,1 до 0.6 изменении рН до 8,5 с шагом:0,5. Затем 40 происходит предварительное выделение, опятьдобавляютсульфатаммониядостепе- .в основном, высокомолекулярных протеони насыщения 0,6. Раствор вспенивают, пе- литических ферментов, которые мешают выну отбирают и процесс вспенивания и отбор делению пектолитических ферментов. При проб повторяют многократно при снижении константе насыщения сульфата аммония . рН до 2,5 с шагом 0,5. Отобранные фракции 45 0,7 — 1,0 выделяются пектолитические ферпены объединяют в одну и используют для менты, освобожденные от протеолитичеполучения протеолитических ферментов, ских. добавляют сульфат аммония до степени на- Изменение рН при каждом значении сыщения 0,7. Раствор вспенивают, пену от- степени насыщения сульфата аммония бирают, доводят рН до 3,0 и снова 50 обусловлено тем, что существуют множествспенивают раствор и отбирают пену. Про- венные формы выделяемых протеолитичецесс вспенивания и отбор пены повторяют ских и пектолитических ферментов, многократно, изменяя рН до 5,5с шагом 0,5, имеющих различные изоэлектрические точПосле отбора .пены при значении рН 5,5 ки в интервале рН от 2,5 до 8,5. сновадобавляютсульфат.аммониядостепе- 55 Пример 1 (известный), Выделение ни насыщения 0,8, раствор вспенивают, пе- пектолитических ферментов проводят. из ну отбирают. Затем снижают рН до 5,0, 100 л концентрата глубинной культуры раствор вспенивают, пену отбирают, Про- Aspetgillus foctldus M-45. рН концентрата цесс вспенивания и отбор пены осуществля- доводятдо3,Оортофосфорной кислотой. За- ют многократно при йзменении рН,до 2,5 с тем в концентрат добавляют сульфат аммо.1712414 ния до степени насыщения 0,8. Смесь активно перемешивают, После полного растворения сульфата аммония смесь барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объем смеси в 1 мин. Образующуюся пену собирают и гасят. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования. Образующаяся жидкость представляет собой высокоактивный очищенный

10 концентрат пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки, С 1 м культуральной жидкости после вакуум-концентрирования получают 100 л концентрата с активностью

40 ед/мл, а после осаждения сульфатом аммония, сбора и гашения пены — 2,2 л раствора выделенных пектолитических ферментов

15 рата глубинной культуры Aspergil)us

foetldus M-45 ед/мл следующим образспа В.

25 концентрат добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,1, доводят рН до 2,5, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пену,.далее процесс вспенивания и отбор проб по.вторяют многократно при изменении:рН. 30 раствора до 8,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,2, вспенивают, отбирают пену. доводят рН до 8,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения сульфата аммония 0,2 повторяют многократно прй изменении рН до 2,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,3, вспенивают, отбирают пену, доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивэния и отбор пены при константе насыщения 0;3 повторяют многократно при изменении рН 1 до 8,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавля- 45 ют сульфат аммония до степени насыщения

0,4, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения 0,4 повторяют многократно при изменении рН.до 2,5 с шагом 0,5, 50 затем в раствор добавляют сульфат. аммо- . ния до степени насыщения 0;5, вспенивают,. отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения 0,5 повторяют многократно при изменении рН. 55 до 8,5 с шагом 0,5, затем в раствор добавля-. ют сульфат аммония до степени насыщения

0,6, вспенивают, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при константе насыщения 0,6 повторяют многос активностью 1778 ед/мл. Суммарная активность пектолитических ферментов.

3,91.10 ед. 20

Пример 2. Выделение пектолитических ферментов проводят из 100 л конценткратно при изменении рН до 2,5 с шагом 0,5.

Полученные фракции пены объединяют и гасят механическим путем. Образующаяся жидкость представляет собой концентрат протеолитических ферментов с активностью 53 ед/мл. Далее в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения

0,7, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 3,0, вспенивают, отбирают пе-: ну, затем процесс вспенивания и отбор пены осуществляют 5 раз при изменении рН до 5,5 с шагом.0,5, далее в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения

0,8, вспенивают, отбирают пену, затем доводят рН до 5,0, вспенивэют, отбирают пену, далее процесс вспенивания и отбор пены при степени насыщения 0,8 производят 5 раз с изменением рН до 2,5 с шагом

0,5, затем в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,9, вспенивают, отбирают пену, далее процесс аспенивания и отбор пены осуществляют 5 раз с изменением рН до 5,5 с шагом 0,5, после этого в раствор добавляют сульфат аммония до степени насыщения 1,0, вспенивают, отбирают пену, доводят рН до 5,0, вспенивэют, отбирают пену, далее процесс вспенивания и от ор пены осуществляют 5 раз с изменением рН до 2,5 с шагом 0,5.

Вспенивание раствора проводят подачей через него воздуха в количестве 0,1 объема на объем смеси в минуту. Отобранную пену при константах насыщения сульфата аммония 0,7 — 1,0 объединяют, гасят механическим путем. Образующаяся после гашения пены жидкость представляет собой концен- . трат пектолитических ферментов, из которо- го препарат выделяют методом лиофильной сушки.

После пеногашения получают 3 л раствора пектолитических ферментов с активностью 1903 ед/мл. Суммарная активность пектолитических ферментов составила

5,71.10 ед.

Таким образом, выход пектолитических ферментов по предлагаемому способу на

46 Д выше, чем по прототипу.

Пример 3. Процесс ведут по примеру

2, но выделение пектолитических ферментов проводят в интервале рН от 2,5 до 8,5;

Суммарная активность пектолитических ферментов составила 5,70 10 ед.

Пример 4. Процесс ведут по примеру

2, но выделение пектолитических ферментов проводят в интервале рН 2,0-10,0.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила

5,73 10 ед.

1712414

Пример K

Выход пектолитических ферментов,, ед. х 10

Отделение протеолитических ферментов

Отделение протеолитических ферментов

Выделение пектолитических ферментов

В ыделение лектолитических ферментов

2

4

6

8

0,3

2,5-8,5

2,5 — 8,5

2.0 — 10,0

3,0-8,0

2,5-5,5

2,5 — 8,5

2,5 — 5,5

2,5-5,5

2,5-5,0

2,5-6,0

0,8

0,7-1,0

0,7 — 1,0

0,7 — 1;О

0,7 — 1,0

0,7 — 1,0

0,7-1,0

0,6-1,0

0,7-1,0

0,7 — 1,0

0,7 — 1,0

3,91

5,71

5,70

5,73

5,29

5,72

5,32

5,01

5,70

5,19

5,70

0,1-0,6

0,1 — 0,6

0,1 — 0,6

0,1-0,6

0,05 — 0,6

0,15 — 0,6

0,1 — 0 55

0,1 — 0,65

0,1 — 0,6

0,1-0,6

2,5-8,5

2,5 — 8,5

2,0 — 10,0

3,0-8,0

2,5-8,5

2,5-8,5

2,5-8,5

2,5-8,5

2,5 — 8,5

2,5-8,5

Пример 5, Процесс ведут по примеру

2, но выделение ферментов проводят в интервале рН 3,0 — 8,0, Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила 5,29 10 ед.

Пример 6. Процесс ведут по примеру

2, но отделение протеолитических ферментов проводят в интервале степени насыщения с 005 до 0,6.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила

572 10 ед.

Пример 7, Процесс ведут по примеру 2, но отделение протеолитических ферментов проводят в интервале степени насыщения с 0,15 до 0,6.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила

532 10 ед, Пример 8. Процесс ведут по примеру

2, но отделение протеолитических ферментов ведут при степени насыщения 0,1-0,55, а пектолитических ферментов в интервале

0,6-1,00.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила

5,01 10 ед.

Пример 9. Процесс ведут по примеру

2, но выделение протеолитических ферментов ведут при степени насыщения 0,1 — 0,65 с интервалом 0,05, а пектолитических в интервале 0,70 — 1,00 с интервалом 0,05.

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов 5,70 10 ед(вы6 ход не увеличен, но возрастает трудоемкость процесса выделения), Пример 10, Процесс ведут по примеру

2, но выделение пектолитических ферментов ведут в интервале рН 2,5 — 5,0.

Интервал степени насыщения, в кото ом и оводится

Суммарная активность выделенных пектолитических ферментов составила

5,19 10 ед.

5 Пример 11. Процесс ведут по примеру

2, но выделение пектолитических ферментов ведут в интервале рН 2,5 — 6,0.

Суммарная активность пектолитических ферментов 5,70 10 ед, 10 Все примеры сведены в таблицу.

Формула изобретения

Способ выделения пектолитических

15 ферментов, предусматривающий добавление в раствор гидролаз сульфата аммония до достижения степени насыщения, необходимой для выделения фермента, и доведение рН раствора до величины, близкой к .

20 изозлектрической точке выделяемого фермента, вспенивание раствора барботированием воздуха с последующим отбором пены и гашением ее, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода пектолити25 ческих ферментов с одновременным выделением протеолитических ферментов, сульфат аммония добавляют с шагом 0,1 до достижения степени насыщения, величину рН раствора доводят до 8,5 и от 8,5 до 2,5 с

30 шагом 0,5 и выделяют из раствора протеолитические ферменты, после чего к оставшемуся раствору добавляют сульфат аммония с шагом 0,1 до достижения степени насыщения и изменяют величину рН раствора до

35 5,5, а затем снижают до 2 5 с шагом 0,5 и выделяют пектолитические ферменты, при этом вспенивание и отбор пены проводят после каждого изменения показателя насыщения и величины рН.

Интервал рН, в котором проводится