Штамм бактерий bacillus sрнаеriсus-продуцент рестриктазы bsi 1

 

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм выделен из пресноводной микрофлоры и хранится в ВКПМ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5446. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bsl I, которая является новым ферментом среди известных рестриктаЗ. Bsl I расщепляет последовательность 51 - CTCGNG - З1 3 -GAGCAC-5( в составе двухцепсГчечной ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэрации в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы. Клетки разрушают ультразвуком й выделяют рестриктазу путем гель-фильтрации на биогеле А 0,5М с последующей хроматографйческой очисткой фермента на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Выход фермента 500 ед/г биомассы. Препарат пригоден для генно-инженерных работ. 1 ил., 1 табл. узнает последовательность 51 -CTGGAG-31, , которая подобно З1 -GACCTC-51 последовательности узнавания Bsf 1 является частично палиндройн ой и совпадает с последней на 4/6. Однако рестриктаза Gsu I не может заменить Bsi I в силу различий их последовательностей узнавания. Известен штамм Anabaena variabllis. продуцирующий рестриктазу Ava I. Ava I узнает последовательность 51 -CTCGAG-31 , которая однако отличается от З1 -G(C)GCGC-5 ё VJ 00 N О Ьь кэ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

Республик (53)5 С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4909301/13 (22) 07.02.91 (46) 30.12,92. Бюл, ¹ 48 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ Научно-производственного объединения "Вектор" и Лимнологический институт СО АН СССР (72) B.Ñ.Äåäêîâ, Н.И,Речкунова, С.Х.Дегтярев, П.А.Жилкин, А.А,Колыхалов и В.А.Верхозина (56) Janulaitis А., Bitinalte J„Jaskeleviciene

В. А new sequence — specific endonuclease

from Gluconobacter suboxydans, FEBS

Letters, 1983, 15, 243 — 247.

Bruce S.À. isolation and characterization от 1@о sequence — specific endonuclease

from Anabaena variabilis, Blochem. J., 1980, 185, 65-75, Gingeras Т,R; et а!.А new specific

endonuclease present in Xanthomonas

holclcola, Xanthomonas peravericola апд

BrevibacterIum luteum.—.J. MoI. Biol. 1978, 118, 113 — 122.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представ ляет собой штамм, который можно использовать для получения эндонуклеазь1 рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 — CTCGNG — 3 в 3 — GAGCAC-5 в . составе двухцепочечной ДНК, Среди продуцентов рестриктаэ известен штамм Gluconobacter suboxydans Н15Т вЂ” продуцент рестриктазы Gsu l. Gsu l, )5U„„1784642 А1

2 (54) ШТАММ БАКТЁФИЙ BAClLLUS

SPHAERICUS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТА3Ы ВЯ!1 (57) Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм выделен иэ пресйоводной" микрофлоры и хранится в ВКПМ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В 5446. Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bst l, которая является новым ферментом среди известных рестриктаз, Bsi расщепляет последовательность 5 — CTCGNG — 3

I I

3 — GAG CAC — 5 в составе двухцепочечной ДНК. Биомассу штамма выращивают при аэраций в питательном бульоне на основе гидролиэата кильки до . Б поздней логарифмической фазы. Клетки разрушают ул ьтразвуком и выделяют рестриктазу путем гель-фильтрации на биогеле А 0,5М с последующей хроматографйческой очисткой фермента на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Выход фермента 500 ед/г биомассы. Препарат пригоден для генно-инжейерных работ. 1 ил., 1 табл. узнает последовательность 5 .-CTGGAG — 3,, которая подобно 3 -GACCTC-5 последоl 1 вательности узнавания Bsil является частичн о йали ндроМн ой и совпадает с последней на 4/6. Однако рестриктаза Gsu

I не может заменить Bsi в силу различий их последовательностей узнавания. . Известен штамм Anabaena variabilis, продуцирующий рестриктазу Ava I. Ана i узнает последовательность 5 -CTCGAG-З, коI I торая однако отличается от 3 -G(C)GCGC-5

1784642 последовательности узнавания рестриктазы Bsi I.

Наиболее близким к изобретению по специфичности продуцируемой рестриктазы является штамм Xanthomonas holclcola, продуцирующий рестриктазу Xho I, узнающую последовательность 5 -CTCGAG-3, 1

3 -GAGCTC-,5 которая однако на 1/6 отлиf чается от последовательности узнавания рестри ктазй 8 st I.

Ч,аким образом,-к йастоящему времени все известные рестриктазы отличаются Ilo последовательностям узнавания от рестриктазы Bsl I. Заявляемый штамм является продуцентом рестриктазы с неизвестной ранее специфичностью, Цель изобретения — получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5 -CTCGTG-3

Предлагаемый штамм выделен в результате поиска продуцентов рестриктаз из пресноводной микрофлоры.

Штамм Bacillus sphaertcus 2В-3 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленныхмикроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (r. Москва) под номером ВКПМ В-5446.

Штамм Вас!Поз sphaertcus 2В-3 имеет следующие характеристики.

Морфологйческие признаки. В молодой культуре (16-18 ч) клетки подвижные, палочковидные, 0,6 мкм в поперечнике и 1,5-3 мкм в длину. Располагаются поодиночке, иногда короткими цепочками. Грамположительные. Клетка способна образовывать сферическую спору, расположенную терминально и раздувающую спорангий, Физиолого-биохимические признаки.

Штамм — строгий аэроб. Каталазоположительный. Не образует кислоту, газ и ацетоин из глюкозы. Кислоту не образует также из арабинозы, сорбита, рамноэы, сахарозы, . мальтозы, лактозы, глицерина, маннита, этанола. Гидролизует желатин, но не крахмал и твин-80. Не восстанавливает нитрат в нитрит, Не образует сероводород и индол.

В аэробных условиях растет на среде из

- гидролизата кильки при температуре от 4 до 40 С (оптимум 37ОC), концентрации NaCI от

0 до 3% (оптимум 0,7%), рН от 6 до 8 (оптимум рН 7). Содержание G+C в ДН К 47% (по плавучей плотности). Культуральные признаки. Среда 1, питательный агар, г/л; панкреатический гид ролизат кильки 17,9; NaCI 5,9; агар 11,2, рН 7,3+ 0,1, После I8 ч инкубирования при

37ОС образует крупные круглые приплюснутые гладкие блестящие сероватые колонии.

Среду используют для оживления культуры, Среда 2, питательный бульон, г/л: гидролизат кильки 33; NaCI 7, рН 7,3 + 0,1. Среду используют для препаративного выращивания клеток. При встряхивании при 37оС

5 культура дает равномерную муть, сгустков не образует.

Штамм Bacillus sphaerlcus 2В-3 — продуцент рестриктазы Bsi I, узнающей и расщепляющей последовательность

10 нуклеотидов 5 -CTCGTG-3 3 -GAGCAC-5 в составе двухцепочечной ДНК, выделен и охарактеризован впервые.

На чертеже изображена электрофорег; рамма разделения в 1%-ном агарозном геле

15 продуктов расщепления ДНК фага Арестриктазами Ача Il + исходная А ДНК (дорожка 1) и Bsl I (дорожка 2). Длины фрагментов маркерной ДНК даны s napax оснований.

20 П г и м е р 1. Культивирование штамма

ВасИЬз sphaericus 2В-3 и выделение рестриктазы Bsi i. Культуру высевают на среду

1 в чашке Петри и инкубируют 17 ч при 37 С.

Отдельную колонию переносят в 200 мл сре25 ды 2 л г, выращиваюг при 37 C. Полученную культуру используют для засева 4 л среды 2 в ферментере фирмы LKB (Швеция). Выращивание проводят при 30 С. с аэрацией 4 л/мин, при скорости вращения мешалки 200

30 об/мин. В конце логарифмической фазы роста (через 6 ч) клетки осаждают центрифугированием и хранят при -20 С. Урожай клеток 4 г/л.

Рестриктазу выделяют по традицион35 ной схеме, включающей разрушение клеток ультразвуком, гель-фильтрацию экстракта на биогеле А 0,5 М с последующей хроматографической очисткой фермента на ДЭАЭцеллюлозе и фосфоцеллюлозе. Препарат

40 хранят в буфере с 50%-ным глицерином.

Выход рестриктазы 500 ед/r биомассы.

Пример 2. Определение активности рестриктазы Bsi 1. Фермент инкубируют 60 мин при 37 С в 30 мкл реакционной смеси, 45 содержащей 20 мМ трис-HCi, рН 8,0; 20 мМ

NaCi; 10мМ МдС!2; 2 мкг ДНК фага iL Затем проводят электрофорез смеси в геле 1%-ной агарозы. За единицу активности принимают количество фермента, достаточное для пол50 ного специфического расщепления 1 мкг

ДНК фага А в этих условиях, Пример 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Bsi I. Специфичность Bsi 1

55 определяют сравнением экспериментально полученным длин рестриктов ДНК фага Х с теоретически рассчитанными из первичной структуры ДНК, Длины фрагментов после гидролиза ДНК фага il рестриктазой Bsi I

1784642 определяют по электрофоретической подвижности относительно маркерных фрагментов (чертеж). При помощи ЭВМ рассчитывают длины фрагментов для всевозможных сайтов узнавания и сравнивают их с экспериментальными данными. Их совпадение (таблица) доказывает, что рестриктаза Bsl I узнает последовательность 5

-СТСОТ6-3 3 -6АОСАС-5 в составе ДНК.

Для подтверждения полученных данных проводят гидролиз ДНК плазмиды pBR322 рестриктазой Bsl I, Фермент расщепляет эту ДНК в положениях: 2655, 4030 и 43401 что также соответствует положенйю сайта 5

-CTCGTG-3 3 -6АОСАС-5 в составе нуклеотидной последовательйости ДНК pBR322.

Экспериментальные и теоретические длины фрагментов ДНК фага Л(в парах оснований) получены при расщеплении ДНК эндонуклеазой рестрикции Bsl I и рассчитаны

5 для сайта 5 -CTCGTG-3 3 -GAGCAC-5 .

Таким образом, преимущество полученного штамма по сравнению с известными состоит в том, что для специфического рас.щепления ДНК по последовательности 510 CTCGTG-3 3 -GAGCAC-5 пригодна только рестриктаза Bsl! заявляемого штамма.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus sphaerlcus

15 ВКПМ 8-5446 - продуцент рестриктазы

BS l 1.

1784642

48502

8IZ6

6И5 бФ92

3676

260о

2555, 2130

2ÎÎ1

/95 I

/6М

ИГО

f289

98S

974

89Ф

5УР

Ид

5If

Составитель В.Дедков

Техред М.Моргентал Корректор А.Козориз

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4348. Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5