Способ получения рестриктазы bsp di
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют B.Sphaericus ВКМ В- 752, который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации , целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.sphaerlcus ВКМ В-752 (DI) содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDI, узнающую и расшепляющую последовательность ДНК 5 ... GATC ... З в количествах , достаточных для получения рестркактазы в препаративных масштабах. Для изошизомера BspDI-рестриктазы Sau 3AI выход очищенного фермента 500 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата рестриктазы Bsp D составляет 1600 - 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 3 - 4 раза превышает указанные цифры для рестриктазы Sau 3AI. (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4828104/13 (22) 24,05,90 (46) 23,01.92. Бюл. М 3 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР (72) Н.Н.Соколов, Н.B:Àíèêåé÷åâà, А,Б.Фицнер, О.Т.Сам ко, А.А. Калугин, Э.Б.Хорошутина и Г. И, Л и брик (53) 577.15 (088.8) (56) Roberts R.J, Nucl. Acids Res., 1989, v, 16, р. 271- З1З. (54} СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ BspDI (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента реИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе в генетической инженерии и молекулярной биологии. Рестриктаэы II класса (сай1-специфические эндонуклеазы) широко применяются при изучении первичной структуры ДНК, в молекулярном клонировании, изучении структурно-функциональной организации генома, выяснении механизмов экспрессии генов, в частности роли метилирования в этом процессе. В литературе описано более 1100 эндонуклеаз рестрикции, одна из которых выделена из Streptococcus aureus 3A. Этот фермент имеет 116 участков узнавания на ДН К бактериофага Л, 87 — на ДН К аденовируса Абг, 8 — на ДНК обезьяннего „„!Ж „„1 707077 А1 стриктазы используют В.Sphaericus BKM В752, который выращивают на питательной среде. содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В,sphaerlcus ВКМ В-752 (Di) содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDt, узнающую и расшепляющую последовательность ДНК 5 ... GATC ... 3 в количествах, достаточных для получен :л рестркактазы в препаративных масштабах. Для иэошизомера BspDI-рестриктазы Sau 3AI выход очищенного фермента 500 ед на 1 г сырого веса биомассы, Выход очищенного препарата рестриктазы Bsp D! составляет 1600 — 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 3 — 4 раза превышает укаэанные цифры для рестриктазы Sau 3AI. вируса SV40, 22 — на плазмиде pBR322 и ни одного на ДН К р 1 74. Содержание рестриктазы БаизА! в 6voмассе S.aureus ЗА не указано, выход очищенного препарата фермента составлял 500 ед/г биомассы, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта, Поиск штамма-продуцента осуществляли с помощью разработанного экспресс-метода определения рестриктазной активности в толуольных лизатах из клеток микроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением в агароэном геле продуктов расщепления ДНК. Поставленная задача достигается тем, что в качестве продуцента рестриктазы исгользуют Bacillus sphaericus ВКМ В-752 (D 1707077 l), который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации. целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Рестриктаза Hsp Dl — изошизомер SauSAI узнает участок нуклеотидной последовательности ДН K 5 .„GATC....З и расшепляет ДНК фага А по 116 участкам, ДНК вируса SV40 — по 8, ДНК плазмиды pBR 322 — rIo 22 и не гидролизует,ДНК ар 174, Штамм Bacillus sphaericus ВКМ B-752 был получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится по номером ВКМ В-752 CCM 1087-Вц 386АТСС 10208= N.R.Smith 966 (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов), Характеристика штамма. Морфологические особенности. Палочки подвижны, грамотрицательны, Культурально-биохимические свойства. На скошенном эгаре рост по штриху обильный. На чашках с мясопептонным агаром колонии крупные, матовые, На мясопептонном бульоне Хоттингера заметное равномерное помутнение, осадок. Отношение к кислороду — аэроб. Лакмусовое молоко — свертывание, пентонизация. Индол — не образует, На глюкозе — кислота+, газ-, маннит-. Желатина уколом — разжижение. Оптимальные условия выращивания и хранения культуры. Культура В.sphaericus ВКМ В-752 хорошо растет нэ твердых и жидких полноценных питательных средах; масопептонном агаре, бульоне Хоттингера, среде LB. Оптимум роста культуры при рН среды 7,2 — 7.4. При рН 10 культура не растет. Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BspDI, достигается в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л 25/ мл основного перевара Хоттин гера, 5 г NaCI, 1 г К2НРО4 и до1 л Н20. Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды. Рабочие культуры пересев от на среду Хоттингерэ один раз в 8 — 10 дней. Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизировэнном виде в ампулах. Выделение рестриктазы BspO(производят фрэкционированием полиэтиленимином и хроматографией на колонках с аффинным сорбентом и ионообменниками. 10 1 Г, 20 4() Инкубационная смесь. для определения акт ивнос и рестриктэзы BspO(обьемом 50 мкл содержит 0,01 М трис-HCI буфер(рН 7,4) 0,01 М гЛ9С(2, 0,001 M дитиотреитэлэ (или :.,007 М 2-меркэптоэтанола) и 2 мкг ДНК фага А . Инкубацию проводят при 37 С в течение 60 мин, Продукты расщепления ДНК фага (. рестриктэзой BspDI анализируют в 1,47ь-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. Зэ единицу активности фермента принимают то минимальное количество (s мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага (. при 37 C за 1 ч инкубэции в стандэр Hûх условиях инкубационной сьлеси. Пример 1. Культуру В. sphaericuз ВКМ В-752 предварительно адаптируют в течение но и при 37 С в условиях аэрации на основной питательной среде, годер>кащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI, 1 г К2НРОл и до 1 л водь:. Инокулят для фермвнтерэ готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из ргсчета 1:10 и размножают в условиях ээрэ (ии. Фар ентацию культуры проводят после добавле. ия B среду инокулятэ в соо ношении 1:10 к объему среды при 37 С в условиях аэрации (рН среды 7,2 — 7,4). Во время выращивания рН культуральI-IeI жидкости поддерживают в пределах 7.1 — 7,6. Выращивание продолжают до дости>кения конца логарифмической фазы роста, Выход сырой биомэссь составляет 3 — 4 г/ культуральной жидкости. Содержание рестриктазы BspOI в биомассе составляет 7000 — 9000 ед/г. Выделение рестриктазы BspD(. 5 I биомассы Bacillus sphaericus ВКМ В-752 суспендируют B буферном растворе клетки разрушают ультразвуком при 2 — 4ОC. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрэцентрифугирования к бесклеточному экстракту добавляют полиэтиленимин до конечной концентрации 1 /, раствор осветляют центрифугираванивм и ведут последовательно храмэта ° рэфию нэ ДЭАЭ-целлюлозе, голубой сефарозе и фосфоцелл юлозе. Получают 10000 ед активности фермента в 10 мл глицеринового буфера Выход счищенногп препарата рестриктэзы 2000 ед нэ 1 г сырого веса биомассы. Препарат рестриктаэы BspDI стабильно сохраняет активность в течение не менее 3 — 5 мес при хранении при -20ОС. Фермент не содержит примесей фосфатаз, экзг>ну.леээ и неспеци1707077 Биомасса штамма Bacillus sphae Bi;M В-752 содержи-< новую эндонуклеазу рестрикции BspDI, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательн:"ть ДНК 5 „. 6АТС ... 3 в количествах. достато нь<х для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы BspDI в биомаcce 7000 — 9000 една1г. Выход о <игце;-: <ой рестриктазы Sau ЗА!, изо иизомера В.;р0<, 500 ед на 1 r блсмассы Составитель F,Сокалов Техред M.Ìopãåíòaë Корректор В.Гирняк Редактор И.Дербак Заказ 241 Тираж Подписное ВНИИГ!И Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 фических эндонуклеаз, пригоден для карт,,— рования ДНК «есех видов генно-инженерных работ Пример 2. Культивирование штал«ла Bacillus spnaericus BKM В-752 проводят аналогично примепу 1, но в качествае питательной среды используют среду LB, содержащую в 1 л 10 г триптона, 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г йаС! и до 1 л воды. Выход биомассы 2,5 — 3,5 г/л культуральной >нидкости. После проведения очистки фермента по примеру 1 выход рестриктазы BspDi составляет 1600 ед/гбиомассы. Таким образом, по предлагаемому способу получают новую рестриктазу Взр0!. Для рестрикTr зы В >p Bt õeä очищ нного фермента составляет 1600 — 2000 ед. активности на 1 г сь рой биомассы, то в 3— 4 pàза превышает известные цифры для 5 Яао3А! (500 ед1. Рестрикт; за BspD! из B.sphacrlcus ВКМ B-752 представляет интерес для молекулярно-;eнетических исследований в плане ее использования для изучения процессов s 1 метилирован ., я ДНК. Эо-; связано с особенностями расщепг.ения сайта узнавания 5 ... ! АТС ... 3 этим ферментом и его лзошиэомерами МЬо и Гкрп!! в зависимости от метил 1рованного основания (адениH или цитозин) 15 в участке узнавания. Формула изобретения Способ получения рестриктвзы BspDl, предусматривающий культивирование проpy« y
