Способ отделения составной части hdl-холестеринсодержащей жидкости

 

Использование: медицина, биохимия. Сущность изобретения: пробу биологической жидкости на средство, состоящее из двух носителей, содержащих осаждающее вещество для всех липопротеинов кроме HDL. Жидкость, прошедшая через носитель, содержит HDL-холестерин, В качестве носителя возможно использовать бумагу и синтетические волокна с диаметром плетения 3-100/ м и толщиной 0,03 0-0, 150 мл или стеклянных волокон, а также возможно использование гидрофильных мембран толщиной 20-250 JUM и диаметром пор 0.2-20 . При этом второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диаметром плетения 0,5-5,0 /IM и влагоемкостью 250-500 г/м2. 2 з.п. и ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

tsi)s G 01 N 33/92

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4831419/14 (22) 31.08.90 (46) 28.02.93. Бюл, М 8 (31) P 3929032.8 (32) 01,09.89 (33) DE (71) Берингер Маннхайм ГмбХ(0Е) (72) B.Pèòòåðñäoðô, У.Денеке, Г.Хиллер, Х,Мердес, К.Бюкер и У.Гебберт (DE) (56) Meth in Engymol. v. 129 (1986). (54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ СОСТАВНОЙ

ЧАСТИ HDL-ХОЛЕСТЕРИНСОДЕРЖАЩЕЙ

ЖИДКОСТИ (57) Использование: медицина, биохимия.

Сущность изобретения: пробу биологической жидкости на средство, состоящее из

Изобретение касается способа и средства для определения HDL (липопротеин высокой плотности) в биологических жидкостях.

Целью изобретения было устранение недостатков существующего уровня техники и разработка способа выделения биологических жидкостей липопротеинов, кроме

НО, который проводится быстро и без дорогостоящих дополнительных устройств, обеспечивает возможность очень быстрого и простого определения HDL-холестерина, Это достигается за счет извлечения иэ биологических жидкостей липопротеинов, кроме HDL, путем нанесения биологической жидкости на носитель, который содержит осаждающее средство для всех липопротеинов, кроме HDL., Осаждение завершается в течение менее 1 мин. В качестве носителей, пропускающих жидкость, можно использовать бумаги„ткани из синтетических волокон (например, полиэфирных и полиамидных), тка Ы 1799472 А3 двух носителей, содержащих осаждающее вещество для всех липоп ротеинов кроме

HDL, Жидкость, прошедшая через носитель, содержит HDL-холестерин, В качестве носителя возможно использовать бумагу и синтетические волокна с диаметром плетения

3 — 100 рм и толщиной 0,03 0 — О, 150 мл или стеклянных волокон, а также возможно использование гидрофильных мембран толщиной 20-250,им и диаметром пор

0,2-20 рм. При этом второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диаметром плетения 0,5-5,0 ими влагоемкостью 250 500 г/м . 2 з.п. и ф-лы, 1 табл. ни из натуральных волокон (хлопка, шелка или смесей этих материалов). При этом ткани могут быть сотканы из моно- или комплексных нитей; предпочтительны ткани из комплексных нитей. Свое преимущество показали волокна, из которых собирается носитель, проницаемый для жидкости, с диаметром волокон от 3 до 100,им, предпочтительно, от 5 до 50,им. Вес 1 м носителя, в частности, составляет от 10 до 100 г/м2, предпочтительно, от 10 до 50 г/м при толщине от 0,030 до О, i50 мм, влагоемкость составляет от 25 до 100 г/м2. предпочтительно, от 40 до 70 г/м, при указанной выше толщине. Другими подходящими носителями являются структуры; проницаемые для жидкостИ, из стеклянных волокон или смесей стеклянных волокон с вышеуказанными волокнами, преимущественно, в нетканой форме. и мембраны с различным исполнением. Мембраны должны обладать гидрофильными свойствами, толщина их

20 — 250,им, предпочтительно 70 — 150 рм, и

1799472 диаметром пор 0,2-20,им, предпочтительно, 5-15рм, Перенос жидкости в этих носителях осуществляется с помощью капиллярных сил.

Осаждающие средства наносятся нэ носитель, предпочтительно, путем пропитывания носителя раствором, эмульсией или суспенэией осаждаемого средства и последующей сушки, При этом могут быть нанесены также еще и другие полезные добавки, как буферные вещества, поддерживающие рН, или смачивэющие вещества, В такой структуре в качестве осаждающих средств пригодны все химические соединения, которые используются для осаждения липопротеинов в растворе, поскольку они достаточно быстро растворяются в жидкости пробы. Особенно известны определенные полианионы в комбинации с двухвалентными.катионами. К ним принадлежат, например, комбинации из фосфовольфрамовой кислоты и хлористого магния, гепарина и хлоридг двухвалентного марганца, или сульфата декстрана и хлорида магния. Следует заметить, что принципиально, каждый из полианионов может взаимодействовать с кажуым из трех катионов (Mg или Мп или Са ) вследствие чего получается несколько различная способность осаждения липопротеинов кроме

HD L.

Для целенаправленного осаждения липопротеинов, кроме HDL должна быть соответственно подобрана концентрация выбранного катиона. Размер молекул используемого полианиона также влияет нэ способность осаждения липопротеинов и должен приниматься во внимание, при выборе концентрации. Например, известно применение сульфата декстрина с молекулярным весом равным 500000 и 50000. Оба пригодны также для носителей, проницаемых для жидкостей, однако предпочтение отдается сульфату декстрина с молекулярным весом 50000 в комбинации c Mg +, причем Мп снова наносится, преимущество, в форме ацетата магния. Однако должны быть использованы, главным образом, также магний сульфат, магний хлорид и аспартат магния, Концентрация осаждающего средства может быть точно соотнесена с объемом изучаемой пробы, Для осаждения не HDLлипопротеинов, пробы приводится в контакт сносите,лем,,проницаемым для жидкости, содержащим осаждающее средство. Тем cBMblM начинается процесс осаждения, Менее «ем за одну минуту, в благоприятных случаях уже после 10 с, заканчивается образование осадка и жидкость из носителя может быть удалена. Этот процесс осуществляется путем непрерывной или дискретной фильтрации под действием сил тяжести или путем отсоса

5 жидкости, Предпочтителен отсос жидкости посредством капиллярных сил в Следующий носитель, в котором происходит отделение, выпавшего в осадок, липопротеина, кроме

Н0, Для этого необходимо, чтобы носители могли контактировать друг с другом, Менее предпочтитель <о отделение осадка другим способом, таким, как, например, центрифугирование, хотя оно также возможно, без

15 отказа от преимуществ. быстрого осаждения. Было установлено, что осадкц липопротеинов, которые образуются при воздействии на биологические пробы комбинации полианионов и указанных двухва20 лентных кэтионов, задерживаются в плетении из волокон, Предпочтительно неупорядоченное распределение волокон в плетении. В качестве волокон предпочтительны стекловолокно и смеси с вышеуказанными волокнами. Преимущество имеют волокна, которые образуют плетения диаметром от 0,5 до 5,0,им. Вес одного квадратного метра .плетения равен от 20 до

50 гlм, предпочтительно вес от 23 до г

30 г/м и влагоемкость от 320 до 420 гlм при толщине от 0,19 до 0,23 мм, Системы, содержащие стекловолокно, их возможное пространственное расположение и размеры волокон описаны в патенте ФРГ N.

3029579. Далее, плетение из волокон может быть упрочнено при добавке соответствующих средств либо неорганической природы (например, жидкое стекло или органической природы например, поливинилацетат, эфир

40 полиакриловой кислоты или другие подобные вещества), Эти добавки влияют, между прочим, на склеивание волокон к местам, на которых они контактируют друг с другом, и этим путем улучшают механическую устой45 чивость волоконного сплетения, Жидкая часть нанесенной пробы беспрепятственно распространяется по всему плетению и может, при подходящем геометрическом распределении, или при преодолении, 50 существующих внутри плетения капиллярных сил, его покинуть. Этим путем можно с помощью простого вспомогательного средства осуществить разделение осаждаемого липопротеина, кроме HDL и неосаждаемого

HDL-липопротеина. Биологическими жидкостями, из которых, в соответствии с предложенным способом, могут быть выделены липопротеины, кроме HDL, являются, прежде всего. цельная кровь. сыворотка или плазма, t799472

Предложенный способ выделения липопротеинов, кроме HDL может особенно выгодно применяться для количественного определения HDL-холестерина с помощью тестовых полосок. Для этого жидкость, из 5 которой, в соответствии с вышеописанным способом были выделены липопротеины, кроме HDL, приводится в контакт с реагентами, которые требуются или полезны для проведения реакции, например, для реак- 10 ции обнаружения холестерина.

Предложенный способ, по сравнению с известным способом, имеет большое преимущество, Можно использовать также небольшой объем жидкостей. Обращение с 15 предложенным средством очень простое, Требуется Только два основных действия, а именно, подача жидкой пробы и регистра-ция измеряемой величины холестерина на фотометре после определенного времени, 20

Отсутствует этап переливания. Можно просто использовать все:сорта крови, а также цельную кровь, когда подключен разделительный холст для клеток. Если к исследуемой пробе должны быть добавлены 25 антикоагулянты, рекомендуется компенсировать вызываемое этим влияние на процесс измерения. Отделение липопротеинов, кроме HDL, происходит менее чем за 60 сек, Дозирование объемов 30 пробы сильно упрощено.

Пример 1, Носитель осаждающего средства для плазмы.

Комплексная полиэфирная ткань (1000йч ячейки, 105 рм толщина ткани, 50 35 нитей на 1-ом сантиметре, с 815 л пропускаемой воды на 1 м и сек.) импрагнируется

" раствором следующего состава, г;

Hepes-буфер, 50рм; рН 7,0 78,00

Ацетат магния х 4 НгО 15,68 40

Сульфат декстрина (Мол.вес 50000) - 2 57

Альбумин (БСА) .. 1,78

На 1 м носителя наносится около 57 мл раствора. После, сушки потоком теплого воз- 45 духа, импрегнированная ткань разрезается на отдельные куски для проведения coolветствующего теста, Пример 2. Носитель осаждающего вещества для сыворотки. 50

Здесь при выполнении работ следует использовать следующий пропитывающий раствор, аналогичный тому, который приведен в примере 1, г:

Нерез-буфер, 50рм; рН 7,0 78,00 55

Ацетат магния х 4 НгО 10,10

Сульфат декстрана (мол, вес 50000) 2,87

Альбумин коровьей

17,14

0,19

1,31

11,70

20 сыворотки 1,78

Н2О 5,58

Пример 3. Носитель осаждающего вещества для крови.

Бумага соответствующей толщины и Ilo глощающей способности, весом 12 г/см и толщиной 50,им импрегнируется следующим пропитывающим раствором, г;

Нерея-буфер, 50 мгр.мол; рН 7,0 70,20

Ацетат магния х 4 HzO 4,78

Сульфат декстрина (мол, вес 50000) 2,54

Альбумин коровьей сыворотки . 1,60

Н20 7,80

С помощью этого носителя достигается нанесение около 63 мл раствора на 1 м .

Пример 4. Реактивная пленка.

Для изготовления реактивной пленки для количественной оценки HDL-холестерина готовится дисперсия следующего состава, г;

К/Na-фосфатный буфер, 0,5М

Кетрол F

TOz (порошок)

Диоктилнатрийсульфосукцинат 0,40

Дисперсия поливинилпропионата (50 в H20)

Диатомовая земля (Келатом, мол. вес. 25) 17,65 ц<енилсемикарбазид 0,025

2/4-гид рокси-3,5-диметоксифенил/-4-/4-демитиламинофенил/-5-метили мида зол-ди гид рохлорид 0,061

Метанол 1,74

НгО 46,28

Холестеринзстераза 23700

Холестериноксидаза 6500

Пероксидаза 230000

Гексанол 2,07

Дисперсия толщиной слоя в 300,им наносится на поликарбонатную пленку и сушится с помощью теплого воздуха.

Получаемый реактивный слой дает в зависимости от содержания холестерина в холестеринсодержащих жидкостях ступенчатую гамму голубых цветов (см. таблицу).

Концентрация Ремиссия, R$ холестерина (при измерениях с помощью отражательного фотометра

Refiotrai R

70,0

43,0

1799472

Составитель Л. Сабурова

Техред М.Моргентал Корректор Н. Король

Редактор

Заказ 793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пример 5, Волоконное плетение.

Смесь из боросиликатного стекловолокна диаметром 0,6 рм и целлюлозных волокон с диаметром волокон около 4 / м. преупочтительно в соотношении 9 к 1. Вес

1 м плетения около 25 г/м при толщине плетения около 0,21 мм; влагоемкость плетения составляет около 370 гlм .

Формула изобретения

1. Способ отделения составной части

НДL-холестеринсодержащей жидкости путем фракционирования биологической пробы, отлича ющи и ся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, фракцио.нирование проводят помещая биологическую жидкость на средство. состоящее из. носителя, проницаемого для жидкости и содержащего вещество, осаждающее липопротеины низкой плотности (LDL) и расположенного под ним другого носителя, 5 задерживающего выпавшие составные части биологической пробы, а прошедшая через с редство жидкость содержит

HDL-холестерин.

2. Способ по и, 1, отличающийся

10 тем, что первый носитель выполнен из бумаги и синтетических волокон, причем волокна имеют диаметр плетения 3 — 100 рм, влагоемкость 25 — 100 гlм, толщину 0,030—

0,150 мм, стеклянных волокон, а также

15 гидрофильных мембран толщиной 20-250,им и диаметром пор 0,2 — 20,им.

3, Способ по и. 1,отл и чаю щи йся тем, что второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диа20 метром плетения 0,5 — 5,0,им и влагоемкостью 250 — 500 г/м .