Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получения @ -амидированного пептида

 

Использование: биотехнология, медицина , биохимия, получение лекарственных препаратов. Сущность изобретения: объектами данного изобретения являются способ очистки а -амидирующей монооксигеназы и способ получения а -амидированного пептида. Пептидил-глициновая а, -амидирующая монооксидаза представляет собой фермент, экстрагируемый из раковых линий клеток и тканей медуллярной железы, имеющий молекулярную массу примерно 60000-65000 дальтон. Она в такой степени очищена, что использование электрофоретической процедуры, осуществляемой на гелях додецилсульфат натрия-полиакриламид обнаруживает единую гомогенную хорошо выраженную полосу, и имеет удельную ферментную активность не менее.50 мЕд на мг белка. Свободный или иммобилизованный фермент в присутствии ионов двухвалентной меди, аскорбата и кислорода может использоватьсядля получения а-амидированного белка из полипептидного субстрата, содержащего глициновый радикал с концевой карбоксильной группой. Изобретение охватывает также способ пол- ; учения а -амидирующего пептида из пептидных или полипептидных субстратов, содержащих концевую глициновую остаточную группу, путем химического взаимодействия данного субстрата с кислородом в присутствии очищенного фермента, аскорбэта или меди. 1 ил. 00 о кэ 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 9/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ ((„) (21) 4027596/13 (86) РСТ/US 85/01616 (26.08.85) (22) 26.05.86 (31) 655366 (32) 27.09.84 (33) US (46) 15.03.93. Бюл, № 10 (71) Юниджин Лабораторис, Инк (US) (72) Джеймз П. Джиллиган и Бэрри Н, Джоунз (US) (56) Bradbury А,F„M,D,F. Finnil and O,G.

Smyth "Mechanism of С-terminal amide

formation by pituctary enzymes" Nature 298, р. 686.-688, 1982,, Bradbury А,F., Smythe О.С., В ВЯ,С„112, ¹ 2. р. 372-377, 1983, Eipper В.А,, R.Å. Mains and С.С, Glembotski. Identification in pituitary tissne

of à peptide а-amidation acivlty that acts on

glycine extended peptides and requires

molecular oxygen copper and ascorbls acid Proc. Natl Acad Sci USA, 80, 5144 — 5148, 1983.

Landymore А,Е. N. et al.. В.В.R,С, vol..

117, ¹1,,р. 289 — 293, 1983. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПЕПТИДИЛГЛИЦИНОВОЙ а -АМИДИРУЮЩЕЙ МОНООКСИГEHA3bl И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а -АМИДИРОВАН НОГО ПЕПТИДА. (57) Использование: биотехнология, медицина, биохимия, получение лекарственных препаратов. Сущность изобретения: объекИзобретение относится к биотехнологии и биохимии.

Известен фермент, обладающий а-амидирующей активностью. присутствующий в

„,,5U „„1802814 А3 тами данного изобретения являются способ очистки а-амидирующей монооксигеназы и способ получения а -амидированного пептида; Пептидил-глициновая а -амидирующая монооксидаза представляет собой фермент, экстрагируемый из раковых линий клеток и тканей медуллярной железы, име- ющий молекулярную массу примерно

60000-65000 дальтон, Она в такой степени очищена, что использование злектрофоретической процедуры, осуществляемой на гелях додецилсульфат натрия-полиакриламид обнаруживает единую гомогенную хорошо выраженную полосу, и имеет удельную ферментную активность не менее.50 мЕд на мг белка, Свободный или иммобилизованный фермент s присутствии ионов двухвалент- . Б ной меди, аскорбата и кислорода может использоваться для получения а-амидированного белка из полипептидного субстрата, содержащего глициновый радикал с концевой карбоксильной группой.

Изобретение охватывает также способ получения а -амидирующего пептида из пептидных или полипептидных субстратов, Со содержащих концевую глициновую остаточную группу, путем химического взаимодействия данного субстрата с кислородом в присутствии очищенного фермента, аскор- Со бата или меди. 1 ил, еЬ свином гипофизе, очищенный с использованием сефагеля-100 до такой степени, что обнаруживает минимальную кажущуюся

1802814 молекулярную массу примерно 60000 дальтон, Целью объекта изобретения способ очистки а-амидирующей монооксигеназы является улучшение качества и чистоты целевого продукта.

Целью является ускорение способа и повышение выхода целевого продукта, Предложенный способ обеспечивает очистку а -амидирующей монооксигеназы экстрагированной из раковых клеток медулярной железы, в частности, ткани И1-10028 спинномозговой карциономы крысы или ее клеточной линии IVI-10029, имеющей молекулярную массу примерно от 60000 до 65000 дальтон, в такой степени, что электрофоретический процесс, осуществляемый на гелях додецилсульфат натрия/полиакриламид, обнаруживает одну единственную гомогенную четко выраженную полосу, и которая имеет удельную ферментную активность не менее 50 м Ед на мг белка (1 Ед. = конверсия одного миллимоля Дансил-Д-тир-Вал-ГлиСООН в 1 миллимоль Данси-Д-Тир-Вал-Со Hz в минуту при 37 С и при величине рН=7,0).

Данный фермент был экстрагирован из . раковых клеток медуллярной железы крысы, которая была привита крысам WAG/Rij

Wistar, как описано Roos В,А. и др., Endocrinology; 1979 г„том 150, N 1, стр.

27 — 32. Эта ткань хранится под официальным номером IVI-10028, Данный фермент был экстрагирован также из других источников, главным образом, раковых линий клеток медуллярной железы человека и крысы.

Линия клеток крысы 77(74) была выделена из раковых новообразований медуллярной железы крысы путем последовательных операций, как описано Muszynshi М., и др.

JBC 1983 r., том 258,. стр. 1167 — 1183, Эта линия клеток хранится под официальным .номером IVI-10029.

Данный фермент выделяют и очищают путем первоначальной обработки, гомогената ткани методом ионообменной. хроматографии. Так, например, образец может быть подвергнут общей весовой нагрузке в препаративной анионообменной колонке, наполненной, например, смолой ДЕ-52, "Whatman, Limited", Продукт, содержащий монооксигеназу с а-амидирующей активностью, затем подвергают хроматографии исключения с использованием смолы с подходящей разделяющей способностью, например в колонке с наполнителем

Sephacryl S-200 очень сильной степени помола, Фракцию элюента, содержащую активный фермент, затем подвергают обработке методом ионообменной хроматографии с использованием сильно анионообменной смолы. Смола, которая может использоваться для данной цели, представляет собой сильную анионообменную смолу Мопо 0 HR5/5, поставляемую

"Pharmacla Fine Chemicals", и для гомогенной очистки фермента может потребоваться один или более проходов через колонку. В каждом этапе очистки может осуществлять10 ся контроль как содержания белка, так и, степени активности а -амидирования. Данная информация используется для расчета удельной активности фермента, которая служит показателем относительной чистоты фермента.

Очищенная пептидил-глициновая а-амидирующая монооксигеназа используется для амидирования альфа-карбоксильной группы полипептида, имеющего концевую глициновую остаточную группу, где глициновая группа функционирует как донор аминогруппы. Пептидный или полипептидный субстрат может быть очищен от естественных источников, синтезированных из составляющих его аминокислот, или может быть получен методами рекомбинантной ДНК, Полипептид с концевым глицином соединяется с кислородом в присутствии эффективного количества фермента. Количество требуемого фермента зависит от различных параметров, хорошо известных, включающих, в частности, (но ограничивающихся ими) следующие: удельная активность данного ферментного препарата, количество и химическая природа подвергаемого конверсии субстрата, время, в течение которого происходит конверсия, и температура и величина рН реакционной смеси. Специалистам в данной области известны другие

40 .параметры, которые могут влиять на точное количество фермента, требуемого для данного процесса, Кислород о 6ыч но испол ьзуется в стехиометрическом количестве, но избыток кислорода не оказывает вредного

45 влияния на реакцию, Наличие ионов меди также необходимо, и эти ионы могут обеспечиваться любой солью меди, которая не оказывает вредного влияния на реакцию, Когда фермент имеет удельную ферментную ак50 тивность примерно 1 м Egl мг белка, то максимальное а -амидирование происходит при концентрации ионов двухвалентной меди 4,7 мкМ, По мере увеличения степени чистоты фермента необходимая концентрация экзогенного иона двухвалентной меди снижается. Ферментная активность может быть увеличена за счет присутствия ионов аскорбата, наличие которых обеспечивается любой солью, пока катион данной соли не

1802814 оказывает нежелательного влияния на реакцию. Для очищенного фермента с удельной ферментной активностью примерно 50 м Eglмг белка максимальная активность а-амидирования имеет место при концентрации аскорбата примерно 5,5 мМ. Активность а-амидирования может быть увеличена путем введения каталазы.

Оптимальная величина рН реакции а -амидирования составляет от 6,5 до 7,5.

Альфа-амидирующая активность очищенной монооксигеназы, отвечающей настоящему изобретению, была продемонстирована с использованием субстрата радиоиодировэнного Д-Тир-Вал-Гли, пептида, последовательность которого имитирует карбоксильную концевую группу меланноцита, стимулирующего предшественник гормона. Анализы осуществляют в 100 мМол, буферном растворе

TES (N-трис(оксиметил)метил-2-аминоэтансульфЬкислота), pH=7,0, при температуре

37 С в течение трех часов, Продукт, / 1/Тир-Вал-NH2, выделяют из субстрата

125 методом катионообменной хроматографии.

Была продемонстрирована также активФ ность амидирующего фермента с использованием синтетического субстрата, который имитировал последовательность карбоксильной концевой группы кальцитонина, /Тир Гли /кальцитонина, и с использова25 33 нием в качестве субстрата фактора высвобождения гормона роста человека, выделенного из рекомбинантного микроорганизма, Хотя данное изобретение описано со ссылкой на предпочтительные принципы его осуществления, для специалистов в данной области должно быть ясно, что могут быть многие варианты и модификации.

Пример 1. Способ очистки альфа-амидирующей монооксигеназы из опухолевых тканей мозговой тироидной карциномы.

Замороженные опухолевые ткани мозговой тироидной карциномы крысы измельчают до крошечных фрагментое и гомогенизируют в 150 мМ Трис, рН 7,5, содеожащем 250 мМ сахарозы, 0,25% N àöåтилглюкопиранозида, 0,1 PMSF, 20 мкг/мл пепстатина и 100 мкг/мл ингибитора трипсина соевых бобов.

Обычно гомогенизируют 25 грамм в опухолевой ткани в 200 мл вышеуказанного буфера на льду, Гомогенизацию осуществляют в четыре импульса по 20 секунд каждый с использованием гомогенизатора Polytron (Brinkman) при установке на 7.

Гомогенат подвергают центрифугированию в течение 15 минут при 9.000xg в роторе фугируют 30 минут при 100.000xg в роторе

sw28 (Beckman) при 4 С. К осветленному гомогенату (svp.3) добавляют достаточное

15 количество кристаллов сульфата аммония

35

50

5

IA-20 {Beckman), а всплывшее вещество (зчр, 1) отстаивается, Осадок вновь гомогенизируют в 60 мл гомогенизационного буфера в ходе 3 импульсов по 20 секунд каждый при установке на 7, Этот второй гомогенат подвергают аналогичному центрифугированию в течение 15 минут при

9,000xg.

Всплывшее вещество после этого центрифугирования (svp,2) соединяют с svp.1, Соединенные svp,1 и svp.2 затем центридля получения 25%-ного раствора сульфата аммония, Добавление кристаллов производят постепенно в течение 15 минутного периода с .постоянным перемешиванием гомогената при 4 С. Спустя дополнительно

30 мин перемешивают при 4 С, смесь центрифугируют 15 минут при 27,000xg в роторе

IA-20 {Beckman) при 4 С. Всплывшее вещество декантируют и добавляют дополни-, тельное количество сульфата аммония к всплывшему веществу до получения раствора с 40% сульфата аммония. После дополнительных 30 минут перемешивания смесь вновь центрифугируют 15 минут при

27.000xg согласно вышеуказанному.

Всплывшее вещество после этого центрифугироеания отбрасывают, а осадок, который содержит по крайней мере 50% активности фермента в гомогенате, вновь переводят в суспензию в 50 мМ Трис HCI, рН 7,0 для получения пробы. Активность составляет 8,2 mv/ìã белка. Затем осуществляют хроматографическое разделение, используя следующие этапы, Гель-фильтрация с сефакрилом S-300.

Вытеснительная хроматография (по размеру), Сефэкрил S-300 (Pharmacia) уравновешивают в 50 мМ трис HCI, pK 7,0 и выливают в колонку К 50/100 (Pharmacia) согласно инструкциям изготовителя. Объем слоя колонки составляет примерно 1,3 литра, Пробу загружают в колонку в объеме, представляющем примерно 3% объема слоя колонки.

Белки злюируют из колонки в 50 мМ Трис

HCI, рН 7,0, при протоке примерно 2 мл в минуту. Фракции по 10 мл собирают и испытывают в отношении альфа-амидирующей монооксигеназной активности с использованием субстрата Dansyl-О-Туг-Vrl-Cly.

Фермент, элюированный из колонки в единичном пике активности, характеризуется молекулярной массой от 60,000 до 65.000 дальтон. Активность составляет по крайней мере 50 mv/ r белка.

1802814

Моно 0 Хроматография при pk 6,0

Сильная анионообменная. хроматография.

Фракции с колонки из Сефакрила S-300, содержащие максимальную ферментную активность, сливают и диализируют с использованием 4 литров 20 мМ бис-Трис буфера рН 6,0. Объединенные фракции затем помещают на колонку Моно 0 HR 5/5 (Фармация), которая предварительно обрабатывалась в соответствии с инструкциями производителя, и уравновешивались в 20. мМ бис-Трис с рН 6,0. После того, как белки, не свяэывающиеся с колонкой, собирались в элюенте с колонки (проток через колонку). связанные белки элюируют с помощью 20 мМ бис-Трис с рН 6,0 с линейным солевым градиентом 0 — 300 MM NaCI. Колонка работает при скорости протока 0,5 мл в минуту, и собирают фракции, каждая по 2 мл. Рас. твор белков, элюируемый с моно 0 колонки при рН 6,0, немедленно нейтрализуется путем сбора его в пробирки, содержащие каждая 200 мкл 1,0 M Трис с рН 7,0, Фракции анализируют на альфа-амидирующую монооксигеназную активность, как и раньше, и наблюдают пик активности, который злюируют с колонки приблизительно при 160 мМ

NaCI. Активность составляла 161 м Eg/ìã белка.

Моно Q хроматография при рН 8,0

Фракции, содержащие пик альфа-амидирующей ферментной активности, от Моно

Q хроматографии при рН 6,0 диализируют с использованием двух обменов каждый по 4 литра 50 MM Tpuc HCI с рН 8,0, Фермент затем помещают на Моно 0 HR 5/5 колонку (Фармация), уравновешенную 50 мМ Трис

HCI с рН 8,0. Белки элюируют в 50 MM Tpuc

HCI рН 8,0 с солевым градиентом 0-300 мМ

NaCl. Используют скорость протока 0,5 мл в минуту, и собирают фракции по 2 мл, Каждую фракцию нейтрализуют добавлением

200 мкл 1,0 M Трис рН 7,0 в каждую из собирательных пробирок. Наблюдают два отчетливых пика ферментной активности при элюировании соответственно при 190 м

М NaCI и 220 мМ NaCI, Активности составляют соответственно не менее 80 м Ед/мг белка и 400 м Ед/мг белка.

Электрофоретический анализ чистоты ферментного препарата с использованием окрашенного серебром S0S полиакриламидного геля на каждой стадии очистки приведен на фиг. 1. Полоса 1: маркеры молекулярного веса (0,5 мкг каждого белка): полоса 2: плавающий на поверхности слой нейтрального экстракта ткани после высокоскоростного центрифугирования (6,9 мкг); полоса 3: осадок 26-46 сульфата аммония (4,7 мкг) от высокоскоростного отделения плавающего на поверхности слоя: полоса 4: размерно-эксклюзионная хроматография осадка сульфата аммония (4,4 мкг); полоса 5:

5 анионообменная хроматография при рН 6,0 (0,5 мкг); полоса 6: анионообменная хроматография при рН 8,0, Полосы 2-6 показывают ферментный состав на последовательных стадиях про10 цесса очистки. Трэк 1 показывает маркеры молекулярного веса и не соответствует ферментному составу. Акти в ность соста ва, соответствующего трэку 2, равна 2.97х10 .

Активность состава, соответствующего трэ15 ку 3, равна 1,89x10 . Состав, соответствующий трэку 4, имеет активность 1,23х10, 5

Активность " состава„соответствующего трэку 5, равна 7,90х10, Состав, соответствующий трэку 6, имеет активность 2,07 х

20 х10.

Пример 2. Получение вещества Р, а -Амидирование биологически уместных / релевантных пептидных гормонов с использованием фермента а -амидирова25 ния.

Несколько субстратов рекомбинантного и синтетического пептидного гормона, включающих субстраты лососевого и человеческого кальцитонина, фактов высвобож30 дения человеческого гормона роста, пептид, родственный гену человеческого кальцитонина, и вещество P человека, получались и успешно а -амидировались с помощью ферментного препарата а -амидирования дан35 ного изобретения, Поскольку скорость а-амидирования зависит от первичной структуры субстрата, для каждого пептидного предшественника условия реакции, требуемые для достижения эффективных скоро40 стей а -амидирования, должны оптимизироваться. С целью иллюстрации ниже описана методика, разработанная для а-амидирования предшественника вещества Р, 45 Вещество P является П-членным пептид. ным гормонам, имеющим а-амидированный метионильный остаток на карбоксильном конце. Пептидный предшественник, содержаший последовательность вещества Р, с растяжением карбоксил-концевого глицила. приготавливался с помощью синтетических методов и использовался в качестве опытного (тест) субстрата для фермента а -амидирования.

При оптимизированных условиях реакции под действием фермента а -амидирования предпоследний метионильный остаток пептидного предшественника быстро превращается в метионин-амид. Соответствующая

1802814 процедура данного превращения заключается в следующем. Лиофилизованный пептидный субстрат (растянутый глицином предшественник вещества Р, 300 наномолей) растворяется в 100 мкл 150 мМ TES буфера, рН 7. К данному раствору субстрата добавляется 50 мкл (приблизительно 1,2 мЩ ферментного препарата а-амидирования, Фермент может происходить или из опухолевой ткани крыс МТС ил из отработанной тканевой культуральной среды от клеточной линии крыс МТС СА-77, Фермент должен очищаться до такой степени, чтобы вся посторонняя протеолитическая активность была удалена. Это обычно достигается с помощью сочетания ионообменной и размерно-зксклюзионной хроматографии. Реакция

Q-àìèäèðoâàíèÿ затем инициируется путем добавления 100 мкл свежеприготовленной смеси, содержащей этанол (2,5, объем/объем), каталазу (0,25 мкгlмкл), =BGK0p биновую кислоту (25 MM) и Твин-20 (0,025% объем) (объем), Указанная выше реакционная смесь тщательно смешивается и инкубируется при 37 С. Эти реакционные условия обычно дают 100% превращение предшественника вещества P в а-амидированный продукт менее, чем за 60 минут.

Очистка продукта может быть легко достигнута с помощью обратно-фазной жидкост- 3 ной хроматографии высокой разрешающей способности, Пример 3, Фактор высвобождения гормона роста человека (ФВГРч) представляет собой гормон пептида с 44 членами, 3 содержащий альфа-амидированный лейциловый остаток на своем карбоксильном окончании. Ген белка слияния для ФВГРч был создан так, что аминокислотная последовательность для гормона пептида была 4 сгруппирована триптофанильным остатком на его окончании амино-,а на его карбоксильном окончании — гпициловым остатком, который также завершал рекомбинантный белок слияния, ФВГРч-содержащий белок 4 слияния изолировали от лизатов рекомбинантного микроорганизма осаждением.

Часть без ФВГРч белка слияния денатурировали путем превращения цистеинильных радикалов в производные S-сульфоната, 5

Так как ФВГРч не содержит триптофана, химическое разложение рекомбинантного белка слияния с реагентом BNPS-скатол расщепляло окислением белок слияния, создавая таким образом неамидированный 5

ФВГРч с карбоксил-терминальным удлинением глицина. Одновременно с этим, метиониловый радикал в положении 27 в молекуле ФВГРч окислялся до сульфоксида метионина. Этот пептид с глициновым удлинением изолировали с использованием гель-фильтрации и жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной

5 фазой. Его структуру устанавливали аминокислотным анализом фрагмента пептидов, полученных в результате переваривания с использованием трипсина.

Предпоследний радикал лейцила пре10 вращали в лейцинамид с помощью воздействия альфа-амидирующего фермента согласно настоящему изобретению, Пример условий, используемых для приготовления альфа-амидированно го Ф В ГРч, будет та15 ким. Лиофилизированный субстрат пептида (20 — 40 наномолей) растворяли в 150 мл деионизированной воды и смешивали с 90 мкл (500 мкед) (рН 7,0) препарата альфа-амидирующего фермента, производного либо из

20 опухоли MTC крысы или из использованной среды для культивирования тканей из клеточной линии СА-77 крысы, Фермент очищали для удаления всякой посторонней активности протеолитического фермента в

25 результате сочетания хроматографии с вытеснением по размеру и ионообменной хроматографии, Добавляли аскорбиновую кислоту и сульфат меди затем к смеси фермента и субстрата в достаточном количестве

0 для получения концентраций в 3 мМ и 2 мкМ, соответственно. Полученный раствор смешивали и инкубировали при 37 С в течение 4-6 ч. Типичный процент превращения субстрата в продукт составляет 95% на ос5 нове аминокислотного анализа фрагментов, высвобожденных при переваривании с трипсином. И, наконец, остаток сульфоксида метионина был восстановлен до метионина воздействием бэта-меркаптоэтанола

0 4М в буфере при рН 4 с 10,мМ ацетата натрия при 80 С в течение одного часа. Конечный продукт очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой и характеризовали его

5 временем удержания, анализом триптического переваривания и аминокислотного анализа, Рекомбинант, альфа-амидированный продукт, также испытывали на биологическую активность, Во всех случаях

0 рекомбинантный ФВГРч был неотличим от синтетического ФВГРч.

Формула изобретения

1, Способ очистки пептидилглициновой а -амидирующей монооксигеназы из исход5 ного гомогената ткани животного, о т л и ч а ющи йся тем,что,сцельюулучшениякачества и чистоты целевого продукта, гомогенэт подвергают анионообменной хроматографии и полученную фракцию, содержащую фермент, подвергают хроматографии исключе1802814

4. Способпоп.3, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют пептид, получаемый с помощью синтеза инвитро, или природный пептид, или полипептид, или пептид, или полипептид, получаемый с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

РУК

° °

ЕЮ 8 @в»

ОВ ф3ЭВ

«4ЯВ

«, ф» фЯ файф

1 °

Составитель Л.Гостеьа

Техред M.Moðãåíòàë

Корректор 3.Палий

Редактор

Заказ 859 : : Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ния по размеру с использованием хроматографического носителя, способного к выделению фермента с мол.м. 60 — 65 кД и удельной активностью не менее 50 мЕд/мг, белка, после чего фракцию элюента, содер- 5 жащую фермент, подвергают сильной анионообменной хроматографии.

2. Способпоп,1, отличающийся тем, что используют ткань 1V1-10028 спинномозговой карциономьг крысы или ее кле- 10 точной линии 1V1-10029, 3. Способ получения а -эмидированного пептида, включающий контактирование субстрата с пептидилглициновой альфаамидирующей монооксигеназой в присутст- 15 вии. кислорода и восстановителя с

12 последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем,что,сцелью ускорения способа и повышения выхода целевого продукта, субстрат контактируют с монооксигеназой, имеющей мол.м, 60-65 кД и удельную активность не менее 25 мЕд/мг белка.