Штамм бактерий viвriо наrvеyi - продуцент рестриктазы vна 464 i

 

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: выявлен штамм-продуцент Vibrio harveyi, синтезирующий эндонуклеэзу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CTTAAG-3 . Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в морской воде и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером BKM B-1833 Д. Штамм продуцирует единственную рестриктазу Vha 464 I, имеющую сайт узнавания , идентичный рестриктазе Afl II, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных работах. Выход фермента Vha 464 I составляет 5000 ед/г сырой биомассы . 1 мл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

is>is С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4938469/13 . (22) 20.05.91 (46) 30,03.93, Бюл. N. 12 (71) Научно-производственное обьединение

"Вектор" и Институт биофизики СО АН СССР (72) В.Е,Репин, С,Х Дегтярев. Н,И.Речкунова, Г.H.Êðèâîïàëîâý, Т,И.Воробьева и А,М.Фиш (73) Научно-производственное объединение

"Вектор" и Институт биофизики СО AH

СССР (56) Catalog "Blolabs", USA, 1988/1989.

Whitehead Р,R., Brown N,l . Three

restrIction endonucleases Апабаепа flosaque, J. Gen. iVIIcrobIol. 1985, v, 131, р, 931

938. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Ч!В%О HARVEYI—

ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ VHA 464 I

Изобретение относится к биотелнол . гии и генной инженерии, в частности к получе. .ию штамма продуцента эндонуклеазы рестри ии, узнающей и расщепляющей последов.:, ьность нуклеотидов 5 -СТТААО-3 .

Цел:;" изобретения являе.:s выявление шта а-продуцента, синтезирующего энло :ук, . эу рестрикции, способную узнавать р: щ--. ",ять:-:-; едоваie;ьн сгь нук леот .„ce 5 -c AAG-3, с повыш;.нным выходом ц эевого фермента. без ин ерферирующи:. активностей.

Это достигается получением штамма

Vibrio harveyI ВКМ В-1833Д вЂ” продуцента эндонуклеазы рестрикции vi а 464 I.

Новый штамм выделен из морской воды в результате система гическо.о поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод.

„„Я) „„1806192 АЗ (57) Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: выявлен штамм-продуцент Vibrio harveyl, синтезирующий эндонуклеэзу рестрикции. способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CTTAAG-3 .

Штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в морской воде и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под регистрационным номером ВКМ В-1833 Д..

Штамм продуцирует единственную рестриктээу Vha 464 1, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Aft ll, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных работах. Выход фермента

Vha 464 i составляет 5000 ед/г сырой биомассы. 1 ил.

Штамм депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов

ИБФМ АН СССР под регистрационным номаро. BKM В 1833 Д.

Фермент Р 1зван Vha 464 I согласно общепри гятой номенклатуре.

Штамм Vibrio harveyi обладает следующими признаками, Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой короткие изогнутые палочки размером 0,5 — 1,0 в ширину и 2,3 — 2,5 мкм в длину, расположенные одиночно, обладают полярно расположенным шгутиком, Подвижны, не образуют эндопор.

Хорошо растет на обычных питательных средах(СПА, МПБ) при температуре 30 С. Колонии на СПА округлые, края ровные, четкие.

Физиолого-биохимические свойства, Грамотрицателен, чувствителен к О/129, 1806192 разжижает желатину, не выделяет сероводород, оксидаэоположителен, обладает слабой люминесценцией, Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 30ф, глицерине при-70 С.

Биотехнологические.свойства. При исследовании разрушенной биомассы в ней обнаружена и выделена эндонуклеаза рестрикции Vha 464 I, споСобная узнавать и "0 расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -СТ AAG-3 .

Определяющими отличиями предлагаемого штамма Vibrio harveyl являются: штамм содержит одну рестриктаэу Vha

464 I вместо трех в прототипе, продуктивность штамма составляет

5000 ед/г (более чем в 15 раз выше, чем у штамма-прототипа).

На чертеже представлена электрофо- 20 реграмма продуктов гидролиза ДНК фага ферментами Afl II u Vha 464 !.

1-ая дорожка — гидролиз Afl И

2-ая дорожка — совместный гидролиз АЛ

Il u Vha 464! 25

3-ая дорожка — гидролиз Vha 464 I, Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штаммапродуцента пересевают бактериологиче- 30 ской петлей на агаризованную среду (на основе 3,5 рыбного гидролизата), содержащего 2ф, NaCI. Чашки Петри помещают в термостат на 30 С, После 10-16 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в 35 колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): рыбный гидролизат 35, хлористый натрий 20 и помещают в термостатированную качалку, Культивируют при температуре 30 С, при 150 об/мин до дости- 40 жения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4 С.

Выделение осуществляют по методике

Bickle, Pirotta, Imber (4). Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы. Фер- 45 мент хранится при -20 С в глицерине.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента, Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК (фиг. 1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5 -CTTAAG-3 .

Выход фермента Vha 464 I определяют по электрофоретической картине гидролиза

ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДН К фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37 С. Выход фермента составляет 5000 ед/г, активность — 5000 ед/мл.

Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известными штаммами: содержит единственную эндонуклеаэу рестрикции Vha 464 I, имеет продуктивность, более чем в 15 раз превышающую штамм-прототип, не требует специального оборудования для культивирования, неприхотлив к питэтельным средам.

Поскольку эндонуклеаза рестрикции

Vha 464 I имеет сайт узнавания, идентичный сайту Afl Il, а выход фермента более высок, то Vha 464! может заменить прототип во всех генно-инженерных работах, Изошизомеры фермента Afl II в СССР до сих пор не найдены, Поэтому производство эндонуклеаэы рестрикции Vha 464 I позволяет полностью отказаться от закупок фермента за рубежом, Внедрение штамма планируется в НИКТИ биологически активных веществ НПО

"Вектор" в 1991-1992 годах.

В настоящее время рестриктаэа Vha 464

l, полученная из Vibrio harveyl, используется для выполнения различных тем НИР во

ВНИИ молекулярной биологии и НИКТИ биологически активных веществ НПО "Вектор", в

Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР, Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio harveyl ВКМ В1883Д вЂ” продуцент рестриктазы Vha 464 1, Составитель В. Репин

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор M. Петрова

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 965 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5