Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо-и арбовирусов

 

Использование: индикация и идентификация штаммов вирусов, принадлежащих к арбовирусам и семейству ортомиксовирусов. Цель: повышение чувствительности диагностикума при выявлении вирусных антигенов . Сущность изобретения: при сенсибилизации эритроцитов в качестве нового коньюгирующего агента используют водный раствор метола в 1,0%-ной концентрации . Сенсибилизацию осуществляют при 53°С в течение 40 мин с суспендированием нагруженных антителами эритроцитов в за- ,буференный физиологический раствор (рН 7,2) со стабилизатором (1 %-ный бычий альбумин ). Положительный эффект: способ хорошо воспроизводим, экономичен и по чувствительности в 6-8 раз превосходит метод приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов при помощи амидола. 7 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4930501/14 (22) 22,04,91 (46) 23,05.93, Бюл.¹ 19 (71) Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР (72) M.X.Ñàÿòîâ, Т.В.Кирюшенко, С.С.Багашева и С.Е.Асанова (56) Кузьмин Ю.А. и др, Лабораторное дело, 1982, N 4, 245 — 247, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ OPTOMMKCO- И АРБОВИРУСОВ (57) Использование; индикация и идентификация штаммое вирусов, принадлежащих к арбовирусам и семейству ортомиксовирусов. Цель: повышение чувствительности ди-

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к вирусологии, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для уско- . ренной диагностики вирусных инфекций и индикации возбудителей в биологических материалах (клещи, комары, кровь больных), собранных в природных очагах особо опасных вирусных инфекций, Цель изобретения — повышение эффективности сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана для получения высокочуествительных иммуноглобулиновых препаратов и расширение возможности применения метода учреждения медицинского и ветеринарного профиля е связи с прекращением промышленного производства амидола, Поставленная цель достигается путем замены конъюгата, снятого с производства, на доступный и дешевый препарат — метал, выпускаемый Львовским заводом "Реак„„5U„„1817026 А1 (я)л G 01 N ЗЗ/531 (:. :ь 44ВЫр ™ >» Ви,sагностикума при выявлении вирусных антигенов, Сущность изобретения; при сенсибилизации эритроцитов в качестве нового конъюгирующего агента используют водный раствор метала в 1,0 — íîé концентрации. Сенсибилизацию осуществляют при

53 С в течение 40 мин с суспендированием нагруженных антителами эритроцитов в забуференный физиологический раствор (рН

7,2) со стабилизатором (1 -ный бычий альбумин), Положительный эффект; способ хорошо воспроизводим, экономичен и по чувствительности в 6-.8 раз превосходит метод приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов при помощи амидола, 7 табл, тив", Отличительным признаком изобретения является использование в качестве конъюгата ранее не применяемого метола в концентрации 1,0% на дистиллированной воде, обеспечивающей высокую чувствительность и специфичность эритроцитарных диагностикумов, применяемых для индикации вирусов в биологических объектах окружающей среды.

Пример 1. 8лияние концентрации метола на эффективность получения эритроцитарных диагностикумов.

К трем порциям 1,0 мл 5,0%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина (кроличьей гипериммунной сыворотки или иммунной асцитной жидкости из расчета 1 мгlмл белка), затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного водного раствора метола различной концентрации: 0,5, 1,0 и 1,5 . Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53 С в течение 40 мин, периодически встряхивая.

1817026

Нагруженные эритроциты дважды отмывают в 2-кратном объеме забуференного физиологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин 0,1 -ной концентрации), Отмытые эритроциты суспендируют в вышеуказанном pacteoph до 0,57ь-ной взвеси. Затем по общепринятой методике ставят РНГА, используя панели микротитратора "Такачи".

Панели оставляют при комнатной температуре (18-22 С) до оседания эритроцитов в контролях. Показано, что максимальное количество выявляемого антигена вирусов гриппа и арбовирусов в исследуемом материа те достигается с эритроцитарными диагностикумами, приготовленными присенсибилизации в присутствии метола в

1,0 -ной концентрации, Использование

0,5 -ной и 1,5 -ной концентрации приводило к снижению титра выявляемого антигена.

Влияние концентрации метола на способ получения эритроцитарных диагностикумов отражено в табл. 1.

Пример 2. Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола.

К трем порциям по 1,0 мл различной взвеси формалинизированных эритроцитов барана: 1,0, 5,0 и 10,0%, добавляют 1,0 мл сенситина и 1,0 мл свежеприготовленного

1,0 -ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре

53 С в течение 40 мин, периодически встряхивая, Затем также как в примере 1.

Результаты, представленные в табл.2, показывают, что наибольшая чувствительность РНГА проявляется с диагностикумами, приготовленными на основе 5,0 -ной взвеси эритроцитов, Взвесь эритроцитов

1,0 и 10 -ной концентрации приводила к снижению показателей выявляемого вирусного антигена, Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола отражено в табл, 2.

Пример 3. Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитов в присутствии метала.

К трем порциям 1,0 мл 5,0 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина, затем вносят

1,0 мл свежеприготовленного 1,0 -ного

pacTBopR метала, Смесь инкубируют в течение 40 мин при различных температурах—

45, 53 и 60 С, периодически встряхивая. Далее как в примере 1.

Как свидетельствуют результаты, представленные в табл.3, сенсибилизации эритроцитов иммунными противовирусными

Специфичность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных предлагаемым способом отражена в табл. 5, Пример 6. Проверка эффективности и преимущества предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов. препаратами имела место при всех испытанных режимах, однако наиболее высокие показатели РНГА получены при температуре инкубации 53 С.

5 Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитов в присутствии метола отражено в табл. 3.

Пример 4, Влияние продолжительности сенсибилизации на эффективность пол"0 учения диагностикумов, К трем порциям 1,0 мл 5,07;-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина, затем — 1,0 мл свежеприготовленного 1,0 -ного водного раствора метола. Смесь инкубируют при температуре 53 С в течение 30, 40 и 50 мин.

Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют с незначительной разнице влияния экспозиции на чувствительность

20 полученных диагностикумов, однако визуально наиболее четкое оседание эритроцитов в контролях получены при сенсибилизации в течение 40 мин.

Влияние продолжительности сенсиби25 лизации на эффективность получения диагностикумов отражено в табл. 4.

11 р и м е р 5. Проверка специфичности эритроцитарных диагностикумов, полученных по предлагаемому способу

30 Эритроцитарные диагностикумы для индикации вирусов гриппа и арбовирусов готовили следующим способом; к 1,0 мл

5,0 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сен35 ситина (1 мг/мл белка), затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного 1,0 -ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53 С в течение

40 мин, периодически встряхивая. Harpy40 женные эритроциты дважды отмывают в

2-кратном объеме забуферен -toro физиологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин

0,1 -ной концентрации). Отмытые эритро45 циты суспендируют в вышеуказанном растворе до 0,5 -ной взвеси. Затем по общепринятой методике ставят РНГА, Указанным примером в табл.5 доказана специфичность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому способу, Эритроцитарные диагностикумы взаимодействовали только с гомологичными вирусными антигенами и не реагировали с гетерологичными.

1817026

Таблица 1

Вируссодержащий материал

Титр РНГА с эритроцитарными диагностикумами, приготовленными с помощью метола в кон ент ации, 0,5

1,0

1,5

А/ Миссисипи/1/85 (H3N2)

А/Тайвань/1/86/(HINI)

В/Энн Арбор/1/86

Клещевой энцефалит (КЭ)

Крымская геморрагическая лихо адка КГЛ

112+ 2,4

56+ 0,8

13,1+ 0,1

158+ 0,5

2048 6,4

2048 + 6,4

958+ 4,5

1670 + 5,5

30,0+ 0,6

30,0+ 0,6

24„0+ 0,4

39+ 0,4

208+ 1,3

1100+ 6,0

239+ 0,2

П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл, 1 — 6 титры антигенов приведены в обратных величинах среднегеометрических титров.

Эритроцитарные диагностикумы готовили по известному и предложенным методами, 1. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана сенситином по из- 5 вестному методу с помощью амидола, Смешивают осадок от 0,4 мл 20 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана с 0,2 мл раствора сенситина и с 0,2 мл свежеприготовленного 0,40 -ного водного 10 раствора амидола, Смесь инкубируют в течение 30 мин при 53 С с периодическим встряхиванием.

2. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана сенситином по 15 предлагаемому методу, Смешивают 1,0 мл

50 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана с 1,0 мл сенситина и 1,0 мл свежеприготовленного 5,0 -ного водно-, го раствора метола, Смесь инкубируют в 20 течение 40 мин при 53 С периодическим . встряхиванием.

Результаты сравнительной индикации вирусного антигена с диагностикумами, приготовленным по известному и предла- 25 гаемому методу. показали значительное преимущество в чувствительности предлагаемого способа и воэможности широкого применения метода в отличие от известного, ограничение которого связано со сняти- 30 ем с производства амидола.

В табл.6 показана высокая эффективность (в 6 — 8 раз) эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому методу, в сравнении с известным 35 (с помощью амидола).

Сравнительная оценка чувствительности эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по известному способу и предлагаемому спосоЬу, дана в табл, 6, 40

Пример 7. Результаты практического применения эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемому способу.

Эритроцитарные диагностикумы, приготовленные по предлагаемому способу, были испытаны при исследовании проб клещей,доставленных работниками Обл.СЭС из природных очагов крымской геморрагической лихорадки, расположенных на территории Казахстана.

Результаты обнаружения антигена вируса крымской геморрагической лихорадки с помощью эритроцитарных диагностикумов, представленные в табл.7, показали явное преимущество применения препаратов, приготовленных по предлагаемому способу.

Выявление вирусного антигена с помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных различными методами, дано в табл. 7.

Помнениюспециалистов головных СЭС предлагаемые эритроцитарные диагностикумы высоко чувствительны и специфичны, Реакция с указанными препаратами легко воспроизводима и может быть применена в условиях быстрого развертывания лаборатории в полевых условиях.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов заключается в высокой их чувствительности при экономичности, простоте и воспроизводимости методики, что позволяет широко использовать указанный способ в практических учреждениях медицинского и ветеринарного профиля, Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо- и арбовирусов путем сенсибилизации эритроцитов специфическими антителами в присутствии конъюгирующего агента, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, используют в качестве коньюгата 1,0 -ный водный раствор метола.

1817026

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

1817026

Таблица 6

Таблица 7

Составитель М.Саятов

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М.Петрова

Редактор T.ÈBàíoaà

Заказ 1720 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Ãàãàðèíà, 101