Способ получения хламидиозного антигена для реакции непрямой иммунофлюоресценции

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики различных хламидийных заболеваний человека и животных. Цель изобретения - повышение специфической активности тест-антигена хламидий. Цель достигается приготовлением из гомогенизированных желточных мешков, содержащих живые хламидий 20%-ной суспензии на среде 199, к которой добавляют 0,05% формалина и 0.1% азида натрия при 4-6°С в течение 72 ч, после чего материал центрифугируют при 500д 15 мин отбирают средний слой, доводят его средой 199 до 5%-ной концентрации и лиофилизируют с 98-99,5% среды 199 и 0,5-2% сахарозы.слсИзобретение относится к медицине, к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики различных хламидийных заболеваний человека и животных.Известен способ получения инфекционных тест-антигенов хламидий из овокультур путем центрифугирования при 500д в тече- 'ние l6 мин гомогенизированной суспензии желточных мешков зараженных куриных эмбрионов. Средний слой, содержащий хламидий, используют в качестве тест-антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики хламидийных инфекций.Однако необходимость применения материала, содержащего живой инфекционный агент, ограничивает практическое использование этого метода.Известен способ получения инфекцион- Hbfx тест-антигенов хламидий из овокультур путем многократного дифференциального центрифугирования гомогенизированной суспензии желточных мешков на солевом растворе с последующей инактивацией возбудителя формалином в конечной концентрации 0.25%.Однако известный способ не обеспечивает достаточного качества полученных тест-антигенов. Обработка возбудителя высокой концентрацией формалина существенно снижает специфическую активность поверхностных антигенов хламидий. Как С/1е.цствие этого снижается интенсивность их специфического свечения при взаимодействии с гомологичными антителами, уменьшается чувствительность реакции. •Жидкие тест-антигены имеют ограниченный срок годности

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) . (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ИО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I (21) 4659329/13 (22) 30.01.89 (46) 15.02.92. Бюл. N. 6 (71) Пермский государственный медицинский институт и Пермский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) О.А.Тимашева, Э.С,Горовиц, Т.В.Леденцова, В.Н,Панкратова и А;А.Шаткин (53) 616:981.71-616.073(088.8) (56) Шаткин А.А. Мавров И.И. Урогениталь ные хламидиозьГ Киев, 1983, с.166.

J. Cttnicat microb., 1980, 12, М 3, 409412. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Изобретение относится к медицине, к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики различных хламидийных заболеваний человека и животных.

Известен способ получения инфекционных тест-антигенов хламидий из овокультур путем цейтрифугирования при 500g в тече ние 10 мин гомогенизированной суспензии желточных мешков зараженных куриных эмбрионов. Средний слой, содержащий хламидии, используют в качестве тест-антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики хламидийных инфекций.

Однако необходимость применения материала, содержащего живой инфекционный агент. ограничивает практическое .использование этого метода. (s1)s А 61 К 39/02, 39/118, G 01 N 33/531 (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики различных хламидийных заболеваний человека и животных, Цель изобретения — повышение специфической активности тест-антигена хламидий. Цель достигается приготовлением из гомогенизированных желточных мешков, содержащих живые хламидии 20%-ной суспензии на среде 199, к которой добавляют 0,05% формалина и 0,1% азида натрия при 4-6 С в течение 72 ч, после чего материал центрифугируют при 500g 15 мин отбирают средний слой, доводят его средой 199 до

5%-ной концентрации и лиофилизируют с

98-99,5%. среды 199 и 0,5-2% сахарозы.

Известен способ получения инфекционных.тест-антигенов хламидий из овокультур путем многократного дифференциального центрифугирования гомогенизированной с суспензии желточных мешков на солевом ° ,.растворе с последующей инактивацией воз- э будителя формалином в конечной концент- (р рации 0,25%. О

Однако известный способ не обеспечивает. достаточного качества полученных тест-антигенов. Обработка возбудителя высокой концентрацией формалина сущест- 1 венно снижает специфическую активность поверхностных антигенов хламидий. Как следствие этого снижается интенсивность их специфического свечения при взаимодействии с гомологичными антителами. уменьшается чувствительность реакции.

: Жидкиетест-антигены имеют ограниченный срок годности {9-12 мес,).

1711898

Цель изобретения — повышение специ.фической активности хламидийного антигеПример 1, Куриные эмбрионы, павшие на 4-7 сут после заражения хламидиями орнитоза, вскрывают в стерильных условиях. Желточные мешки помещают в колбу со стеклянными бусами и тщательно гомогенизируют. Затем на среде 199 из них готовят

20%-ную Маточную суспензию, Добавляют азид натрия 0,1 и формалин 0,05, выдерживают суспензию при 4 С в течение 72 ч., После этого суспензию центрифугируют при 5009 в течение 15 мин. Образовавшийся средний слой (нижний — частицы ткани, верхний — жир), переносят в стерильную про.бирку и доводят средой 199 до 5%-ной концентрации.

Полученный таким образом хламидийный антиген смешивают со стабилизатором состава, мас.%: среда 199-98; сахароза — 2, разливают по ампулам по 0,25 мл, ампулы помещают в специальные металлические кассеты и лиофилизируют на сублимационных установках. Рабочий вакуум в течение цикла не более 13,33 Па. Температура конденсатора в начале высушивания не выше

-50ОС, в течение цикла не выше -47 С. Начальная температура материала в период сублимации-(45 10) С, Конечная температура досушивания (25 - 5) С. По окончании высушивания кассеты с препаратом немедленно закрывают крышками, помещают в эксикатор и герметизируют запайкой.

Пример 2, Получение неинфекционных тест-антигенов из Chiamydla р$!Пас! возбудителя энзоотического аборта овец (штамм ЕАЕ), Способ осуществляют так, как указано в примере 1, но в качестве исходного материала используют желточные мешки куриных эмбрионов, зараженных возбудителем энзоотического аборта овец.

Пример 3. Получение неинфекцион. ных тест-антигенов из С! trachomatis, возбудителя уретрита (штамм ЛБ-1). Способ осуществляют так, как указано в примере 1, но в качестве исходного материала используют желточные мешки куриных эмбрионов, инфицированных штаммом ЛБ-1, Пример 4, Получение инфекционных тест-антигенов из С!.trachomatis, возбудителя венерической лимфогранулемы (штамм

Л-2). Способ осуществляют так, как указано

s примере 1, но в качестве исходного материала используют ..желточные мешки. куриных.эмбрионов. зараженных штаммом Л-2.

Эффективность инактивации штаммов хламидий в исходном материале различными концентрациями азида натрия и форма10

20 лина контролируют введением этого материала после 72 ч инкубации при+4-бЯС в желточные мешки шестидневных развивающихся куриных эмбрионов. Использование азида натрия в концентрации 0,1-0,15% и формалина 0,05% обеспечивает полную инактивацию различных штаммов хламидий. Это позволяет значительно снизить концентрацию формалина (до 0,05 ), применяемую для инактивации возбудителя, следовательно, уменьшить его влияние на специфическую активность поверхностных антигенов.

Специфическую активность полученных тест-антигенов хламидий с использованием различных концентраций формалина и азида натрия определяют титрованием гомологичных иммунных cbIBopoToK методом непрямой флюоресценции (см. табл.).

Таким образом, положительный эффект от использования способа заключается в повышении специфической активности хламидийного антигена, что отражается на чувствительности реакции. а также на удлинении срака хранения тест-антигенов и возможнОсти транспортировки лиофилизированных препаратов. При этом повышается технологичность процесса приготовления диагностйкумов, поскольку

30 инактивация возбудителя в отличие от известного способа проводится сразу после го-: могенизирования инфицированных желточных мешков, следовательно, все последующие операции по приготовлению

35 тест-антигенов осуществляют уже с неинфекционным материалом. Это особенно важно при работе со штаммами возбудителя орнитоза, которые относятся к второй группе патогенности

Формула изобретения

Способ получения хламидиозного антигека для реакции непрямой иммунофлюоресценции, включающий культивирование хлаМидий в куриных эмбрионах,.гомогенизацию инфицированных желточных мешков, суспендирование клеток в солевом! растворе с последующей инактивацией формалином и отделением целевого про50. дукта, о т л и ч à ю шийся тем, что с целью, повышения специфической активности антигена, после гомогенизации клетки суспендируют в среде 199, инактивацию проводят формалином в смеси с азидом натрия в ко-.

55 нечной концентрации 0;05 и 0,1% на объем суспензии соответственно, далее целевой продукт смешивают со стабилизатором состава, мас.%: среда 199- 98-99.5: сахароза — 0,5-2, и лиофилизируют.

1711898

Резулататы титроеамию сывороток больных хюаеетиозон методом йенрюиой июиунорпаооесцбицми с иеиирекционнсеи тест-антигеиаии хлаимлий, лолучеиеаею лрм ислолеаоеании раа к ммактиайрукцмх концентраций акиле натрию и фориалма

Концентрацию аанйа натрию

YNtp cII9opoToIc с антисаиюии Ns RTl9ooo5 хлаиийий, обработанных р ихнюю@и концентрациюмм Еориалина .

Лори

EAE

0105 0>1

Л-2 ЛБ-I

0,05 f 0,1 1 o,as f 0, o,os (0,1

32

З2

64,, 3. Хламмйиммаи, CNINNHI итон

,1.512 64

5I2 64 .

256 128.!

2S6 64

256 64 рации аабйа

Ланы а ацйе обратных аемчин комйент натрию и 0ормалимр - и ° р + ° . титры антител э мроцентех.Фрине

Составитель А,Горбатов:

Редактор: H.Касарда . Техред М.Моргентал КорректоР С,Шевкун Подписное

Заказ 485 Тираж к ытиям и и ГКНТ СССР, ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат . Патент", . р д, у .

" г Ужго о, л.Гагарина, 101 ! брнитоаом

s

0,1 .

0,15

0,1

0,15 <

0,1

0. I5

0,!

0, 15 о,!

0,15

0.1

О.!5

256 .

256

512

512.

512

512

32

З2

64

64 .

64 !

28

128

128

128 в а

16

16

16

16!

28

128

256

256

256

256

З2

32

64 1 . 64

64

64

64

32

32

32

В

32 .З2

16

-а.

16.16 . гб 1б

512 .„т ф

SI2

256 - - -128

256 ., 128

256 64

256 64

32

32

64

64.

64 64 а а

16

16

16 !